Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo
Summary
Las células que mueren son expulsados de los tejidos epiteliales por la contracción concertada de las células vecinas sin interrumpir la función de barrera. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. A continuación se describen los métodos para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra a una resolución de celulares.
Abstract
Mantenimiento homeostático de los tejidos epiteliales requiere la eliminación continua de las células dañadas sin afectar la función de barrera. Nuestros estudios han encontrado que las células que mueren enviar señales a sus vecinos en vivo para formar y contratar a un anillo de actina y miosina que se expulsa hacia fuera de la hoja epitelial al cerrar las lagunas que pudiera haber resultado de su salida, un proceso llamado extrusión de la celda 1. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. Aquí se describe un método para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra. Para visualizar la extrusión, se inyecta una sonda roja de la proteína fluorescente etiquetados para la F-actina en los embriones de una célula etapa pez cebra transgénico que expresa la proteína verde fluorescente en la epidermis e inducir la apoptosis mediante la adición de G418 para las larvas. A continuación, el uso del tiempo-lapse de imágenes en un microscopio confocal de disco giratorio para observar la dinámica de actina y los comportamientos de las células epiteliales durante el proceso de extrusión celular por apoptosis. Este enfoque nos permite investigar el proceso de extrusión en vivo epitelio y proporcionar una vía para estudiar los estados de enfermedad causada por la falta de eliminación de células apoptóticas.
Protocol
Discussion
El protocolo se describe aquí se muestra un método simple y sencillo de visualizar el proceso de extrusión en un tejido epitelial en vivo. Este tipo de experimento nos permite examinar las sutilezas de la dinámica de actina no se había supuesto en los análisis de tejidos fijados, y por lo tanto, complementa los métodos comunes de inmunofluorescencia. Podemos utilizar este protocolo en combinación con inhibidores químicos o mutantes genéticos para analizar mejor el proceso de extrusión y los estados estudiar l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Rosenblatt para los debates científicos, sugerencias y comentarios. También nos gustaría agradecer a María Halloran, quien amablemente proporcionó el plásmido que codifica RFP-UtrCH Grunwald y David, que siempre que el CK: GFP pez cebra transgénico. Gracias también a Gretchen Rey y el personal de los recursos de pez cebra centralizada en la Universidad de Utah para el mantenimiento de una excelente y el cuidado del pez cebra. Esta labor fue apoyada por Premio a la Innovación de Nueva NIH-NIGMS director de los NIH de un DP2 OD002056-01 a JR. GTE fue apoyado por el NIH Multidisciplinario del Cáncer Programa de Capacitación 5T32 subvención CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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