Bildproduktion för cell Extrudering från överhuden av utvecklingsländer Zebrafish
Summary
Döende celler extruderade från epiteliala vävnader genom samordnad kontraktion av angränsande celler utan att störa barriärfunktion. Den optiska klarhet utveckla zebrafisk ger ett utmärkt system för att visualisera extrudering i levande epitel. Här beskriver vi metoder för att framkalla och bild extrudering i larvernas zebrafisk överhuden på cellulär upplösning.
Abstract
Homeostatiska underhåll av epitelvävnader kräver kontinuerlig avlägsnande av skadade celler utan att störa barriärfunktion. Våra studier har visat att döende celler skickar signaler till sina bo grannar att bilda och kontrakt en ring av aktin och myosin som matas ut från epitelceller arket medan utgående eventuella luckor som kan ha resulterat från dess utgång, kallas en process cell extrudering 1. Den optiska klarhet utveckla zebrafisk ger ett utmärkt system för att visualisera extrudering i levande epitel. Här beskriver vi en metod att framkalla och bild extrudering i larval zebrafisk epidermis. Att visualisera extrudering, injicera vi en röd fluorescerande proteinet märkt probe för F-aktin i en-cells stadiet transgena zebrafisk embryon uttrycker grönt fluorescerande protein i epidermis och inducera apoptos genom tillsats av G418 till larver. Vi använder sedan tidsförlopp avbildning på en snurrande skiva konfokalmikroskop att observera aktin dynamik och epitelceller beteenden cell under arbetet med apoptotiska celler extrudering. Detta tillvägagångssätt tillåter oss att undersöka extruderingsprocessen i levande epitel och ger en aveny för att studera sjukdomar som orsakas av underlåtenhet att eliminera apoptotiska celler.
Protocol
Discussion
Protokollet som beskrivs här visar på en enkel och okomplicerad metod för att visualisera processen av extrudering i en levande epitelvävnad. Denna typ av experiment tillåter oss att undersöka nyanser av aktin dynamik som inte tidigare uppskattat i fast vävnad analyser, och därför kompletterar gemensamma immunofluorescens metoder. Vi kan använda detta protokoll i kombination med kemisk-hämmare eller genetiska mutanter att bättre analysera extruderingsprocessen och studera stater sjukdom i samband med underl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar av Rosenblatt laboratoriet för vetenskapliga diskussioner, förslag och kommentarer. Vi vill också tacka Maria Halloran som välvilligt lämnat plasmiden kodning RFP-UtrCH och David Grunwald som tillhandahöll CK: GFP transgena zebrafisk. Tack också till Gretchen kung och personalen i den centraliserade Zebrafish Resurs vid University of Utah för utmärkt underhåll och skötsel av zebrafisk. Detta arbete stöddes av NIH-NIGMS NIH direktörens Nya Innovator Award 1 DP2 OD002056-01 till JR. GTE fick stöd av NIH Tvärvetenskaplig Cancer träningsprogram Grant 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
