Summary
以下协议概述的隔离，通风和稽核小鼠肺组织措施稳定或搏动性肺血管压力 - 流的关系，以量化的血流量，气流，气道的变化和血管的变化，右心室后负荷的影响的过程。
Abstract
隔离，通风，允许稳定和脉动的肺血管压力 - 流的关系，对肺动脉流量，流速波形，气道压力和左心房压力独立控制测量仪表小鼠肺癌准备。基于多点，稳定的压力流量曲线计算肺血管阻力，肺血管阻抗是搏动性的压力 - 流的频率范围内获得的曲线计算。由于目前临床上公认的，阻抗比电阻右心室后负荷的一个优越的措施，因为它包含了血管顺应性的影响，这是不容忽视的，尤其是在肺循环。 “三个代表”重要指标的阻抗-零赫兹阻抗Z 0，特性阻抗Z C，和波反射ř W指数-提供洞察到远端动脉横截面积流量，近端动脉僵硬度和上下游的阻抗不匹配，分别为。在隔离所得的全部结果，通风和灌注肺是独立于交感神经系统的音，卷状态和麻醉的效果。我们已经用这种技术来量化肺栓塞和慢性缺氧电阻和阻抗的影响，并区分行动网站（即近端与远端）血管活性药物和使用 Z C的压力依赖的疾病。此外，当这些技术与基因工程菌对小鼠的肺部用于，分子水平上对肺血管的结构和功能缺陷的影响，可以决定的。
Protocol
在这个协议中，我们展示了一个孤立的，通风，灌注小鼠肺准备以前已使用量化肺栓塞和慢性缺氧对搏动性肺血管压力流量关系的影响（Tuchscherer，韦伯斯特，Chesler，2006年; Tuchscherer等，2007）。简言之，小鼠肺手术从周围组织中分离出，放置在一个加热室（IL - 1，哈佛大学器械，Holliston，马）和通风（通气控制模块（VCM）- R的定时器计数器模块（TCM），哈佛大学器械）。肺血管灌注加热的RPMI 1640细胞培养液中，用3.5％聚蔗糖，使用注射泵（科尔 - 帕默，美国Vernon Hills，IL）产生源源不断的波形或一个高频振荡泵（玻色 - 电磁力，伊甸园大草原，MN）在与注射泵创建搏动性肺血管流波形并联。压力传感器（P75，哈佛仪器）测量瞬时肺动脉压（PAP）和左心房压力（LAP）。瞬时流量（Q）是衡量行流量计（跨音速系统公司，美国纽约州伊萨卡）。脉动压力 - 流的关系是来自这些测量，提供洞察到肺血管的生理和病理及右心室后负荷。
1。设备：
- 肺隔离设置，包括鼠标呼吸机
- 数据采集系统和计算机与LabVIEW程序
- 两个压力传感器和流量计灌流流
- 压力传感器和流量计（pnemotachometer）气道流
- 高频振荡泵和计算机用Win测试程序
- 臂/变焦镜，灯
- IL - 1系统具有高输出泵的暖气浴
2。准备的IL - 1系统
- 蒸馏水加热至37 ° C的加热浴的IL - 1系统的内部传阅。
- 所有泵，传感器和IL - 1套管连接，通过清洁管子和所有油管刷新蒸馏水加热至37 ° C。气泡，这可能会进入肺部，引起水肿旅游，必须拆除。振荡流泵，流量传感器，流量传感器的油管肺动脉导管，用1％PBS冲洗。
- P75压力传感器归零，关闭阀门的导管，打开阀门的气氛，然后推PLUGSYS放大器自动调零按钮。然后，到大气中的阀门关闭，打开阀门的导管。
- IL - 1系统的通风途径的多孔陶瓷片湿提供湿度。
3。解决方案
- 准备量聚蔗糖的RPMI解决方案和无菌过滤介质3.5％。过滤介质，确保没有大的颗粒可能无意中栓塞肺。用无菌媒体也减少了突发发展中国家在肺水肿的可能性。每个实验试验手术用RPMI一个60毫升注射器，用RPMI填写一个10毫升注射器。在37℃水浴加热的灌流。
- 准备肝素鼠标（近似）500IU/100g体重1毫升。肝素盐158IU/mg。为1〜25克鼠标，用1ml PBS解决方案，在一个小的离心管中混合1.25毫克肝素盐。
4。通风一个滑鼠指标
- 后腹腔注射150毫克到老鼠的每公斤溶液中苯巴比妥，确保深麻醉，一爪子上执行硬捏。如果没有反应，准备手术鼠标寄希望于它的前爪corkboard稳定。注：整个实验过程中麻醉深度监测，仔细观察动物。爪子和频繁的切口引脚作为伤害性刺激，缺乏应对证实，动物仍然在手术麻醉平面。
- 喷雾用95％酒精湿毛皮和使用直钳抓住颈部皮肤的胸部。切1厘米的皮肤在使用直剪刀开放。
- 一旦暴露颈部内侧，除去所有的白色腺体组织和浅肌层，寻找食道和气管。从组织分离的食管和气管两侧和后部。
- 下插入气管的小弯钳和缝合对方抢到一块。根据气管拉缝合，并配合一个松散的外科医生结。不要收紧缝合或喜结良缘。
- 切一个小角度，在气管与小剪刀“V”，不切断所有通过气管。软木板和鼠标移动到加热的IL - 1系统。使用两个钝钳，抢气管插管和气管下方的“V”。然后，滑入气管插管泽EA通过的“V”开幕。拧紧气管周围的缝合和气管插管，以确保里面的气管插管。喜结良缘。
- 开始与室内空气的通风（50％的灵感，90次/ min，深吸气，）。
5。灌流一个通风的鼠标
5.1。进入右心室注入肝素
- 喷雾酒精鼠标胸部再次重新弄湿皮草。以上胸部的肋骨，用直钳和直剪上删除所有的皮肤。沿胸骨向上切。电梯在每边的皮肤，然后切开皮肤下面较低的肋骨。
- 抓住在胸骨用镊子底部剑突过程中，切孔进入隔膜采用了直板的剪刀。抓住镊子的隔膜，从肋骨。
- 再用镊子抓住剑突（左手）和使用的球头，直角剪刀切断了通过肋骨的胸骨和，小心不要切肺，心脏或血管（使用球头剪刀来引导你）。将有血，但只要是剪刀的尖端对胸骨，心脏和肺部不会被削减。
- 抓住左侧肋骨和肋骨必要暴露心脏剪去。慢慢地注入0.1毫升的肝素液的右心室。这一步很重要，以防止血液凝块，在肺，损伤内皮细胞，并会损害灌注。必须注射肝素，而心脏还在跳动。
5.2。 Cannulate主肺动脉
- 切去其余的肋骨（左侧和右侧）使用回（四舍五入）结束镊子轻轻推肺部远离肋壁。敛肺，自己会损害娇嫩的组织。剪刀的技巧和肺组织之间的偶然接触也会造成损害。
- 显微镜移动到超过肺癌的地方。切去心脏上方的腺体和脂肪组织。使用镊子把它拉离的动脉和静脉，然后用弹簧剪刀削减，而组织张力。
- 使用另一个镊子钝瓢，从心顶部左侧下左心房/心室下的主动脉和肺动脉（PA）的镊子的尖端。仔细做到这一点不应该有抵抗镊子。使用生硬的镊子降低，不小心刺破肺动脉或主动脉的可能性。
- 一旦镊子尖下的主动脉和PA，抢一块缝合，转危为安。打结宽松的外科医生。不要收紧缝合或喜结良缘。
- 可选：使用直角剪刀去除身体的下半部分。减少通过肋骨和脊柱;切割主动脉和腔静脉会造成大量的血液流向 - 使用棉条，以坚定的流量。放置在一个袋子处置。
- 总理PA导管与4毫升的RPMI 10 ml注射器从。仔细检查所有的管子无气泡。灌注肺，用蒸馏水或气泡会导致水肿。
- 剪下右心室游离壁的小凹口，插入PA导管，旨在向下和向右。导管的尖端应通过透明墙的PA可见。注入少量的RPMI确认您的位置。周围的导管，主动脉和PA拧紧缝合，并喜结良缘。请注意，在这一点上，主动脉也追平，所以实际灌注不应该开始直到左心房是空心的。
5.3。 Cannulate的左心房
- 切了一个档次，降低左心室的一部分，和惰性的左心房（LA）的套管，旨在向上。轻微的压力，可能需要打开这个方向的二尖瓣。在正确的位置，导管尖端漏网之鱼和安全无需缝合。
5.4。开始灌注
- 手动注入0.3毫升每分钟的RPMI直到RMPI是显而易见的，在流出管（粉ISH在色彩对比明确PBS），从10毫升注射器。如果没有流流出管，重新定位的LA套管。如果没有流出可以得到重新定位，检查肺动脉泄漏。在肺动脉泄漏或撕裂，无法修复;这是导致中止实验。
- 60毫升注射器连接PA的导管通过IL - 1系统，并开始为1ml/min灌流输液，检查泄漏和确保肺部变成白色，这说明的RPMI是取代在肺部的血液。两分钟的慢血流灌注。
6。测量脉动和稳定的肺动脉高压流量关系
- 脉动流的研究，第一组的振荡泵活塞位移WinTest根据以前的实验方案针对每一个频率所需的水平。由于变性，肺的结构和力学的位移必须为每个鼠标调整。源源不断设置到所需的程度。打开阀门的振荡泵，并开始运行前的振荡流配置文件（Wintest程序）记录数据。打开数据文件，并绘制在Excel（Q）的实验流程。调整在每个频率的振荡泵活塞位移（Wintest方案）使Q MAX和Q民需要。
- 稳流试验，关闭阀门的振荡泵。如果此阀处于打开状态，振荡泵作为一个电容器，抑制的变化到另一个，从一个流量。收集至少10秒的数据，在每个流量或直到PA压力不超过5％。
- 搏动性或稳定的流量测量，在数据收集前的恒压老通风。数据收集后立即恢复通风。
- 观看的RPMI在气道管，这是水肿的证据，并中止试验的原因。另外，不要让我们的RPMI达到气道压力或流量传感器，因为它会损坏传感器。
7。代表性的成果：
代表稳定的结果：
设置隔离肺实验者有能力独立控制，不仅肺流量Q，但也气道压力P空气和左心房压力圈。这是有利的，因为Q，P 空气和LAP影响肺血管，导致肺动脉压PAP的。另一个好处是，得到的结果是独立于交感神经系统的音1，卷的状态，和麻醉2。
在Q阶梯变化引起的空气固定的p和固定或不同的LAP PAP的变化如图1所示。请注意，在孤立肺准备，LAP的导管通常连接管，指示物的容器灌流。有了这个油管，LAP是问，由于Poiseuille流线性依赖。但是，可以手动调整的出口和废物容器的高度，以提供一个恒定的，非零圈或油管可以去掉，让零LAP的独立是问
代表脉动结果：
虽然可以用此系统生成任意脉动流波形，我们通常会产生流动的形式：Q = 3 + 2罪（2 fπt）毫升/分钟的 F = 1，2，5，10，15和20赫兹的频率评估肺血管（图2：顶部面板）的线性阻抗。从PAP，搭接和Q测量，计算肺血管阻抗值（Z）和相位（θ）第一每个施加正弦流量频率分解成一系列ΔP= PAP - LAP和Q的一个完整的正弦周期使用傅立叶变换的正弦谐波。压力比改造流向变换产生的肺vascualar阻抗，PVZ = FFT（△P）/ FFT（问），幅度Z和相位θ。输入阻抗Z 0的特性阻抗Z C，和波反射ř W指数，计算出阻抗值。 Z 0，特别是从Z计算零谐波（F = 0赫兹）的平均以上的所有频率，Z C的Z之间的第一次最低（5赫兹）和20 Hz的平均计算，和ř W是计算（Z 0 - Z C）/（Z + Z C）3。
图1稳流波形（上排）和由此产生的压力（第二行：PAP，P 空气 ，LAP）与圈和P 空气不同的组合功能的时间。最后一行显示与问：人民行动党在（A）和（B）与Q的单圈成绩的增加和下降，因为流出管到位。 （三）使LAP是恒定的，并问：独立，在（D）和（五）出口管的高度为手动调节，这样的LAP较高， 但独立于问：P空气，无论是在油管被删除吸气末（A，C，D）或呼气末（B，E）的压力。
图2脉动流波形问（顶部面板）和压力（底部面板：PAP，LAP和P 空气 ）作为时间的函数。 PVZ从这些搏动性肺压力 - 流的关系，可以计算的，它反映了总的右心室后负荷。
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Discussion
在手术的关键步骤
这是关键，护理是采取切割时从肺部肋骨。必须充分暴露肺和不羁周围组织在通货膨胀，但不是在隔离的过程中损坏。可用于使用一个平面物体如镊子后端举行胸壁肺剪刀削减，以便有一个清晰的路径。另一个关键的一步是缝合肺动脉和主动脉周围的位置。使用钝直镊子将降低肺动脉穿刺的风险。手术过程中的最后关键的一步是插管的位置。如果套管以上的飞机，因为他们退出心脏大血管太高，肺动脉或肺静脉插管可以拉。如果在左心房插管太低，它可以阻止流量进入左肺。因此，更多的流右肺，增加PAP和加速发展在右侧肺水肿。
数据收集过程中的关键步骤
稳流数据采集应快速进行，尤其是对高流速，使肺血管暴露于高流体剪切应力最小化。根据我们的经验，高剪切应力，导致肺水肿。此外，在剪应力迅速增加，可引起肺水肿。源源不断的条件，增加流6毫升/分钟/分钟不引起水肿。稳流率超过5毫升/分钟，可没有在一定的条件下水肿。我们有稳定的流速为10毫升/分钟成功灌注控制肺部慢性缺氧小鼠。
频率限制
我们测试的最高频率通常为20赫兹，因为我们使用了流波：Q = 3 + 2罪（2 Fπt）毫升/分钟。我们在这里描述的泵可以在更高的频率（至少50赫兹）的振荡，但是权衡减少中风的长度，即，在问一个生理流动波形流振荡幅度随着频率的增加而降低的变化可能会与这个系统模拟。另外，自定义灌注泵可用于具有相同的手术分离和这里描述的通风程序。压力传感器的频率范围（P75，哈佛器械，Holliston，马）报告为0-100赫兹。传感器的实际频率响应取决于用于的传感器连接到PA和LA插管管的刚度和大小。使用金属代替聚乙烯管材管会增加系统的响应。然而，它不可能完全使用刚性管，导管的位置和布局的灵活性，因为在手术过程中所需要的。然而，更高的频率响应传感器和/或更严格的管将增加在压力测量的噪声信号，使PVZ要在更高的频率获得。
应用
这个与世隔绝的肺制剂已被用于探讨搏动性肺压力-流量关系的影响以及慢性缺氧5肺栓塞4。它也被用来调查6肺循环血管活性药物的影响，并量化的近端和远端的肺血管的影响急性Rho激酶抑制 7 。这种技术可以用来量化自交系或远交株在小鼠的肺血管的生理或遗传工程小鼠8。这个与世隔绝的肺准备的压力，流量数据的解释并不复杂小鼠品系之间的心率和心输出量的差异。重要的是要注意阻抗谱在一个孤立的，在一个非生理性的波形通风灌注肺不应该直接相比，那些体内准备在正常心脏跳动。此外，在体内，通风是消极的，不积极，压力和血液粘度约4倍的RPMI粘度与聚蔗糖。
意义
使用隔离，通风，灌注小鼠肺的准备，我们已经能够显示急性Rho激酶抑制平滑肌细胞去激活，没有直接的影响大，导管动脉显着的影响RV 后负荷7遵守。近端动脉顺应性的临床重要性已越来越认识到 9-11 。此外，减少主肺动脉遵守已被证明是一个出色的预测肺动脉高压的死亡率在 10,11 。 DEAT主要事业H是从肺动脉高压右心功能不全，但平均肺动脉压增加，单是不足以导致失败 12 。一个更有效的措施，总的右心室后负荷是PVZ，这取决于双方的近端遵守和远端的阻力，是搏动性肺压力 - 流的关系，可以在小鼠肺组织与本议定书获得计算。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由国家卫生部授予R01HL086939（NCC）研究院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 10 ml syringe | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| 60 ml syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| RPMI with GLN 6/PK | Fisher Scientific | MT10040CV | |
| Bottle Top Filters | Fisher Scientific | 09-761-57 | |
| Ficoll PM 70 | Sigma-Aldrich | F2878-100g | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | ||
| Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Angled Ball Iris scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 4mm Blades | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine Iris Scissors - straight | Fine Science Tools | 14106-09 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Dumont Medical Biology Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lauda E100 ECO-line 003 | VWR international | Comparable to Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922 | |
| IL-1 Isolated perfused mouse lung system | Harvard Apparatus | 739904 | |
| Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Harvard Apparatus | 730020 | |
| TS410 Flow Modules | Transonic | TS410 | |
| ME 4 PXN Precision PXN Inline Flowsensors | Transonic | ME 4 PXN | |
| Cole-Parmer Multi-Syringe Pumps | Cole-Parmer | EW-74900-20 | |
| Nembutal 50MG/ML 20ML Vial | Amatheon |
References
- Pace, J. Sympathetic control of pulmonary vascular impedance in anesthetized dogs. Circ Res. 29, 555-568 (1971).
- Ewalenko, P., Stefanidis, C., Holoye, A., Brimioulle, S., Naeije, R. Pulmonary vascular impedance vs. resistance in hypoxic and hyperoxic dogs: effects of propofol and isoflurane. J Appl Physiol. 74, 2188-2193 (1993).
- Nichols, W. W., O'Rourke, M. F., Hartley, C., McDonald, D. A. McDonald's blood flow in arteries : theoretical, experimental, and clinical principles. , 5th edn, Arnold. (2005).
- Tuchscherer, H. A., Webster, E. B., Chesler, N. C. Pulmonary Vascular Resistance and Impedance in Isolated Mouse Lungs: Effects of Pulmonary Emboli. Annals of Biomedical Engineering. 34, 660-668 (2006).
- Tuchscherer, H. A., Vanderpool, R. R., Chesler, N. C. Pulmonary vascular remodeling in isolated mouse lungs: Effects on pulsatile pressure-flow relationships. Journal of Biomechanics. 40, 993-1001 (2007).
- Vanderpool, R., Naeije, R., Chesler, N. Impedance in Isolated Mouse Lungs for the Determination of Site of Action of Vasoactive Agents and Disease. Ann Biomed Eng. , (2010).
- Vanderpool, R., Kim, A., Molthen, R., Chesler, N. Effects of acute rho kinase inhibition on chronic hypoxia-induced changes in proximal and distal pulmonary arterial structure and function. Journal of Applied Physiology. , (2010).
- El-Bizri, N. Smooth muscle protein 22alpha-mediated patchy deletion of Bmpr1a impairs cardiac contractility but protects against pulmonary vascular remodeling. Circ Res. 102, 380-388 (2008).
- Champion, H., Michelakis, E., Hassoun, P. Comprehensive invasive and noninvasive approach to the right ventricle-pulmonary circulation unit: state of the art and clinical and research implications. Circulation. 120, 992-1007 (2009).
- Gan, C. Noninvasively assessed pulmonary artery stiffness predicts mortality in pulmonary arterial hypertension. Chest. 132, 1906-1912 (2007).
- Mahapatra, S., Nishimura, R., Sorajja, P., Cha, S., McGoon, M. Relationship of pulmonary arterial capacitance and mortality in idiopathic pulmonary arterial hypertension. J Am Coll Cardiol. 47, 799-803 (2006).
- Bogaard, H. Chronic pulmonary artery pressure elevation is insufficient to explain right heart failure. Circulation. 120, 1951-1960 (2009).
