घायल प्रवाह cytometry द्वारा स्पाइनल कॉर्ड ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन: एक सेल शोधन विधि के लिए एक उपन्यास का प्रयोग करें

Summary

प्रवाह cytometry से घायल / रोग सीएनएस में सेलुलर सूजन की मात्रा का ठहराव / लिपिड माइलिन मलबे है कि समान आकार और दानेदार बनाने कोशिकाओं को, संवेदनशीलता / कम सटीकता कर सकते हैं द्वारा जटिल है. हम एक सेल तैयारी विधि माइलिन मलबे को हटाने और घायल रीढ़ की हड्डी में प्रवाह cytometry द्वारा कोशिका का पता लगाने में सुधार उन्नत है.

Abstract

घायल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रतिरक्षा कोशिकाओं (सीएनएस) रूपात्मक या histological तकनीक का उपयोग कर की जांच हमेशा सच सेलुलर सूजन के मात्रात्मक विश्लेषण नहीं प्रदान की है. प्रवाह cytometry एक त्वरित वैकल्पिक विधि घायल मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं यों है. ऐतिहासिक, प्रवाह cytometry करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को रक्त या अलग तिल्ली या thymus से एकत्र यों इस्तेमाल किया गया है, और केवल कुछ अध्ययनों से घायल रीढ़ की हड्डी में ताजा अलग गर्भनाल ऊतक का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिरक्षा कोशिकाओं यों का प्रयास किया है. हालांकि, अलग रीढ़ की हड्डी के ऊतकों है कि कोशिकाओं के लिए गलत हो सकता है और कोशिका गिनती प्रवाह cytometer द्वारा प्राप्त विश्वसनीयता कम माइलिन मलबे के साथ ध्यान केंद्रित किया है. हम एक सेल तैयारी कोशिकाओं से प्रभावी ढंग से अलग मलबे / लिपिड माइलिन OptiPrep ढाल प्रणाली, प्रवाह cytometry से घायल रीढ़ की हड्डी में सेलुलर सूजन के संवेदनशील और विश्वसनीय quantifications प्रदान विधि उन्नत है. के रूप में हमारे हाल ही के अध्ययन में वर्णित (बेक और गुयेन एट अल, मस्तिष्क Feb 2010, 133 (2 पं.):. 433-47), OptiPrep सेल तैयारी घायल रीढ़ की हड्डी में सेलुलर सूजन का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता बढ़ गया था की गिनती के साथ, विशेष सेल प्रकार चोट गंभीरता के साथ correlating. गंभीर, इस पद्धति का उपन्यास उपयोग तीव्र और जीर्ण एससीआई के बाद सेलुलर सूजन का पहला लक्षण वर्णन प्रदान करने के लिए polymorphonuclear leukocytes के लिए एक पूर्ण समय पाठ्यक्रम (PMNs, neutrophils), / मैक्रोफेज microglia, और टी कोशिकाओं को एक अवधि में 2 घंटे से लेकर शामिल 180 दिन के बाद चोट सेलुलर सूजन का एक आश्चर्य की बात उपन्यास दूसरे चरण की पहचान (डीपीआई). सेलुलर सूजन की इस पद्धति का उपयोग करके पूरी तरह से लक्षण वर्णन घायल सीएनएस में neuroinflammation की एक बेहतर समझ प्रदान करते हैं, कर सकते हैं और neuroinflammation का एक महत्वपूर्ण multiphasic घटक है कि डिजाइन और तर्कसंगत चिकित्सीय उपचार कार्यनीतियों के कार्यान्वयन दोनों सेल आधारित और औषधीय सहित, के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है प्रकट एससीआई के लिए हस्तक्षेप.

Protocol

1. रीढ़ की हड्डी ऊतक के पृथक्करण रीढ़ की हड्डी गैर घायल या contusion रीढ़ की हड्डी की T8-T10 घायल (T9 पर चोट) Sprague Dawley चूहों dissected और कमरे के तापमान पर HBSS में ठीक कैंची के साथ यंत्रवत् अलग क्षेत्रों, के रूप में पहले वर्णित 1. ऊतक हदबंदी से पहले पूरी रीढ़ की हड्डी कॉलम कॉर्ड T8 T10 क्षेत्रों की निकासी से पहले 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर रखा गया था. ऊतक बिट (1 मिनट, 1000 rpm, कमरे के तापमान) centrifugation और enzymatically 2.5 मिलीग्राम trypsin और 5 5 मिलीलीटर DME (है Dulbecco संशोधित है ईगल मीडिया) में 20 मिनट के लिए मिलीग्राम 37 पर ° collagenase trituration पहले सी (के साथ अलग से पुनर्प्राप्त थे ~ 10 बार कमरे के तापमान पर एक गिलास पाश्चर विंदुक (9 इंच) के साथ). DME 10 +% भ्रूण गोजातीय सीरम के 10 मिलीलीटर की कोशिकाओं को जोड़ा गया enzymatic गतिविधियों को बाधित करने और फिर एक 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर्ड किया गया था. एक त्वरित स्पिन के बाद, सेल गोली HBSS के 6 मिलीग्राम में resuspended था और OptiPrep ढाल नीचे वर्णित समाधान पर overlayed. 2. OptiPrep ढाल समाधान बनाना पतला OptiPrep MOPS बफर (0.15 एम NaCl, 10 मिमी MOPS, 7.4 पीएच) के साथ OptiPrep 01:01 गिराए द्वारा निर्मित किया गया था. चार OptiPrep ढाल समाधान मिश्रण 350, 250, 200, या 1 मिलीलीटर (1 टेबल) के अंतिम मात्रा HBSS के साथ 150 μl पतला OptiPrep द्वारा किए गए थे. चार समाधान धीरे धीरे और ध्यान से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में थे परतों में तल पर कम से कम पतला और शीर्ष (चित्रा 1 ए) पर सबसे पतला के साथ रखा. 3. / लिपिड कोशिकाओं से माइलिन मलबे अलग HBSS में dissociated रीढ़ की कोशिकाओं के 6 मिलीग्राम ध्यान OptiPrep ढाल समाधान के शीर्ष पर स्तरित किया गया था. ट्यूब युक्त कोशिकाओं और ढाल समाधान (15 मिनट, 1900 rpm या 726 आरसीएफ, 20 ° C) centrifuged था एक रोटर स्विंग बाल्टी (A-4-62) के साथ एक Eppendorf अपकेंद्रित्र 5810R का उपयोग कर, अलग अलग परतों में लिपिड के साथ सेल समाधान / myelin (7 शीर्ष ट्यूब के मिलीलीटर) मलबे, न्यूरॉन्स के भड़काऊ कोशिकाओं, glia, गोली में और लाल रक्त कोशिकाओं के साथ 3 परतों द्वारा पीछा किया. हालांकि सबसे monocytes, मैक्रोफेज, PMN granulocytes, और लिम्फोसाइटों सहित भड़काऊ कोशिकाओं, गोली में पाए गए, कुछ बड़े आकार सक्रिय मैक्रोफेज गोली ऊपर परतों में पाया जा सकता है. मलबे / लिपिड माइलिन परत (7 शीर्ष मिलीलीटर) को ध्यान से aspirated था हटाया. कोशिकाओं तो धोया गया और 2.5 मिलीलीटर HBSS में resuspended और नीचे immunolabeling के लिए इस्तेमाल किया. 4. प्रवाह cytometry के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के Immunolabeling कक्ष (500 μl) रीढ़ की हड्डी की तैयारी से एकत्र pelleted थे और 5 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिकाओं lyse लिए 0.85% अमोनियम क्लोराइड (आसुत पानी में पतला) में resuspended. कक्ष 500 μl HBSS साथ धोया गया और तब सामान्य या कमरे के तापमान पर माउस सीरम खरगोश में 30 मिनट के लिए अवरुद्ध. कक्ष धोया गया और एंटीबॉडी के साथ 1 घंटा (खरगोश विरोधी PMN FITC, सटीक रासायनिक और वैज्ञानिक, ED1 488 Alexa, Serotec माउस विरोधी चूहे, या विरोधी चूहे माउस CD3 488 Alexa) के लिए कमरे के तापमान पर incubated निर्धारण या आईजीजी समाधान में पतला HBSS (1:100 कमजोर पड़ने पर सभी), के रूप में 1 पहले से वर्णित है . कक्ष में दो बार प्रत्येक ऊपर और फिर कदम अंतिम चरण के बाद 300 μl HBSS में resuspended के बाद धो रहे थे. 5. सेल प्रवाह cytometry द्वारा मात्रात्मक निर्धारण नमूने FACS Calibur (Becton Dickinson) प्रवाह cytometer सेल क्वेस्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग पर विश्लेषण किया गया. नमूना प्रति 5,000 घटनाओं के सभी नमूनों के लिए पढ़ रहे थे, और डेटा विश्लेषण (DakoCytomation) शिखर सम्मेलन के साथ पूरा किया गया था. प्रवाह cytometric फाटक नियंत्रण आईजीजी निर्धारण लेबल कक्षों या रिहाई का नियंत्रण जानवरों से रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं का उपयोग कर समय अंक भर में सामान्य के लिए के रूप में 1 पहले से वर्णित आधारभूत मूल्यों को निर्धारित करने के लिए सेट किया गया. सकारात्मक लेबल कोशिकाओं का मतलब मान पूरे नमूना का प्रतिशत (SEM ±) के रूप में व्यक्त किया गया. 6. प्रतिनिधि परिणाम: एक OptiPrep ढाल की क्षमता माइलिन मलबे को हटाने और प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिरक्षा सेल का पता लगाने में सुधार 1 पर रीढ़ की हड्डी PMNs बढ़ाता द्वारा मूल्यांकन किया गया था डीपीआई (चित्रा 1 बी), एससीआई 1-3 PMN घुसपैठ के बाद के पहले की रिपोर्ट चोटी. वैकल्पिक रूप से, हूबहू dissected स्पाइनल तार enzymatically माइलिन मलबे के OptiPrep हटाने के बिना अलग थे और इसी तरह प्रवाह cytometry द्वारा PMN घुसपैठ के लिए समानांतर में मूल्यांकन. के रूप में हम एक पहले की रिपोर्ट है, वहाँ OptiPrep ढाल शुद्धि एंजाइमी अकेले पृथक्करण की तुलना में विधि के साथ अलग नमूनों में घटनाओं की स्थिति में बदलाव था, अक्षुण्ण माइलिन मलबे के साथ नमूनों में पाया PMNs का प्रतिशत का प्रदर्शन केवल एक अंश (0.5% ) पता चला PMNs OptiPrep purif में प्रतिशत (5.1%) केआइईडी नमूने (चित्रा 1 बी). ये आंकड़े बताते हैं कि ऊतक तैयारी में myelin मलबे प्रवाह cytometric रीडिंग अस्पष्ट कर सकते हैं, और प्रदर्शन माइलिन मलबे की है कि हटाने घायल रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में प्रतिरक्षा सेल का पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाता है. घायल रीढ़ की हड्डी में सेल का पता लगाने के लिए OptiPrep ढाल प्रणाली की संवेदनशीलता की स्थापना करने के बाद, हम एक अवधि में 2 बजे से 180 डीपीआई लेकर सेलुलर घुसपैठ में परिवर्तन की विशेषता और एससीआई के बाद एक उपन्यास सेलुलर सूजन के multiphasic प्रतिक्रिया है कि PMNs मैक्रोफेज शामिल की स्थापना की / microglia और टी कोशिकाओं. पिछले 1-3 अध्ययन के द्वारा पुष्टि की है, PMNs पहले 2 बजे के बाद चोट की हड्डी में प्रवेश किया और 1 पर डीपीआई (चित्रा 2 और 4) नुकीला. / अन्य 1,4,5 हाथ पर मैक्रोफेज microglia घायल रीढ़ की हड्डी में 3 डीपीआई जब तक नहीं पता चला रहे थे, और 7 डीपीआई (चित्रा 3 और 4) पर शुरू में नुकीला. हैरानी की बात है, हम पहली बार है कि / मैक्रोफेज microglia दूसरी बार 60 डीपीआई के लिए नुकीला और 180 डीपीआई (चित्रा 3 और 4) के माध्यम से बुलंद बने रहे के लिए दिखाते हैं. मैक्रोफेज / microglia, के लिए भी इसी तरह टी सेल घुसपैठ 7 डीपीआई 5-7 शिखर भविष्यवाणी की थी, तथापि, प्रवाह cytometry टी सेल संख्या में कोई परिवर्तन पहले 7 डीपीआई में नहीं लगा था टी कोशिकाओं के एक ऊंचा संख्या का पता चला गया था हालांकि, 9 बजे डीपीआई (1.6%) (चित्रा 4). जबकि टी सेल संख्या 10 dpi है, एक लगातार टी सेल प्रतिक्रिया 180 डीपीआई के माध्यम से मनाया गया, जो समय पर कोशिकाओं के 4.4% CD3 (चित्रा 4) के लिए लेबल किया गया द्वारा कम था. साथ में, इन आंकड़ों एससीआई के बाद सेलुलर सूजन (चित्रा 4) के समय पर निर्भर multiphasic प्रतिक्रिया का प्रदर्शन, सेलुलर सूजन के प्रारंभिक चरणों PMNs 1 के प्रारंभिक चोटी शामिल थे डीपीआई ED1 के एक चोटी + मैक्रोफेज / microglia 7 डीपीआई और टी द्वारा पीछा कोशिकाओं 9 dpi है, जबकि बाद के चरणों के सभी तीन सेलुलर 14 डीपीआई के बाद बढ़ती है और 180 डीपीआई के माध्यम से बने 60 डीपीआई पर एक उल्लेखनीय / मैक्रोफेज microglia के दूसरे शिखर के साथ आबादी का बना रहे थे. यह timecourse अध्ययन और मात्रात्मक प्रवाह cytometry द्वारा उत्पन्न डेटा पहले से पुष्टि की है, immunolabeled रीढ़ की हड्डी की एक वर्गों के मात्रात्मक stereology से एकत्र आंकड़ों के लिए तुलनीय परिणाम दिखा . तालिका 1. माइलिन मलबे को हटाने के लिए OptiPrep ढाल की तैयारी चार OptiPrep ढाल समाधान HBSS और पतला OptiPrep (OptiPrep और MOPS के 01:01 मन्दन) का उपयोग कर बना रहे हैं. चित्रा 1. OptiPrep ढाल घनत्व अलग सबसे माइलिन / घायल स्पाइनल कॉर्ड / ऊतकों की कोशिकाओं से मलबे और प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिरक्षा सेल मूल्यांकन में सुधार. (ए) Myelin / मलबे कोशिकाओं (न्यूरॉन्स, glia और प्रतिरक्षा कोशिकाओं) से dissociated रीढ़ की हड्डी ऊतक के एक OptiPrep ढाल के माध्यम से माइलिन / मलबे परत की आकांक्षा के बाद centrifugation के बाद अलग किया गया था. (बी) घायल रीढ़ की हड्डी में PMN नंबर, मलबे को हटाने के बाद PMNs का पता लगाने में वृद्धि की संवेदनशीलता (छात्र के टी – परीक्षण, पी .0001 =) दिखा. N = 5 प्रति समूह, ± SEM मतलब, सभी प्रवाह cytometric फाटक रिहाई जानवरों से लेबल कोशिकाओं का उपयोग कर सेट किया गया. सभी नमूनों के लिए नमूना प्रति 5,000 घटनाओं पढ़ रहे थे और सकारात्मक लेबल कोशिकाओं का मतलब मान पूरे नमूना का प्रतिशत (SEM ±) के रूप में व्यक्त किया गया. चित्रा 2 प्रवाह cytometry से घायल रीढ़ की हड्डी में PMN घुसपैठ की जांच. एक मध्यम (200 केडी) T9 पर contusion चोट के बाद, PMNs जल्दी रीढ़ की हड्डी की हड्डी 2 (बी) के बाद चोट बजे शुरू और बढ़ता जा डीपीआई 1 (सी) में प्रवेश किया. सभी प्रवाह cytometric फाटक रिहाई जानवरों से लेबल कोशिकाओं (ए) का उपयोग कर स्थापित किया गया. चित्रा 3 मैक्रोफेज / प्रवाह cytometry से घायल रीढ़ की हड्डी में microglia घुसपैठ की जांच. एक मध्यम (200 केडी) T9 पर contusion चोट के बाद, ED1 संख्या + बृहतभक्षककोशिका / microglial घायल रीढ़ की हड्डी में वृद्धि 3 डीपीआई (डी) में शुरू, तीव्रता 7 डीपीआई (ई) पर नुकीला, डीपीआई 14 (एफ) में निम्न स्तर को गिरा दिया पहले 60 डीपीआई (जी) में एक दूसरे पीक करने के लिए बढ़ रहे हैं, और 180 डीपीआई (एच) घायल रीढ़ की हड्डी में बने रहे. 7 डीपीआई रीढ़ की कोशिकाओं के आईजीजी निर्धारण नियंत्रण लेबलिंग (बी) न्यूनतम पृष्ठभूमि एंटीबॉडी लेबलिंग और 2 बजे से एंटीबॉडी लेबल कोशिकाओं (सी) के बाद घायल या रिहाई (ए) जानवरों के लिए कोई अंतर नहीं दिखाया. सभी प्रवाह cytometric फाटक रिहाई जानवरों से लेबल कोशिकाओं का उपयोग कर स्थापित किया गया. तालिका 2. Timecourse प्रयोगों में पशु के नमूने हर बार बिंदु (0 घंटा 180 के लिए डीपीआई) के लिए पांच पशुओं T9 पर एक उदारवादी (200 केडी) contusion चोट प्राप्त ,और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों प्रवाह cytometry द्वारा PMNs, ED1 + मैक्रोफेज / microglia, और CD3 + टी कोशिकाओं की संख्या के लिए मूल्यांकन किया गया. हालांकि, सभी जानवर नहीं नमूने (4-5) PMN, ED1 (3-5), और CD3 (4-5) cytometric विश्लेषण प्रवाह के लिए सफलतापूर्वक बरामद किए गए. चित्रा 4. एक मध्यम (200 केडी) T9 पर contusion चोट के बाद रीढ़ की हड्डी में सेलुलर सूजन के एक timecourse . के रूप में प्रवाह cytometry PMNs की संख्या, ED1 + मैक्रोफेज / microglia, और CD3 द्वारा मूल्यांकन + कोशिकाओं, टी तीव्रता नुकीला (1,7, और 9 डीपीआई, क्रमशः) और घायल रीढ़ की हड्डी में लंबे समय से कायम n = 3 से 5 प्रति समूह, ± SEM मतलब है.

Discussion

प्रवाह cytometry CNS में प्रतिरक्षा कोशिकाओं यों का उपयोग लिपिड / माइलिन सामग्री और मलबे के द्वारा जटिल है. एंटीबॉडी बंधन और विशिष्टता के साथ दखल के अलावा, myelin मलबे समान आकार और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए दानेदार गुण है, माप संवेदनशीलता और ^{सटीकता} 8 कम कर सकते हैं . उपन्यास सेल तैयारी यहाँ वर्णित विधि माइलिन मलबे को हटाने में प्रभावी है और जिससे प्रवाह cytometry घायल रीढ़ की हड्डी में सेलुलर सूजन में परिवर्तन का पता लगाने की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है. उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की इस पद्धति का पता लगाने बढ़ाया द्वारा माइलिन मलबे को हटाने के एंजाइमी alone.Critically पृथक्करण की तुलना में, इस विधि का उपयोग उपन्यास तीव्र और जीर्ण सूजन सेलुलर का पहला लक्षण वर्णन की अनुमति के बाद एससीआई PMNs के लिए एक पूर्ण समय पाठ्यक्रम को शामिल करने के लिए, मैक्रोफेज / microglia, और 180 डीपीआई टी कोशिकाओं, और सेलुलर सूजन के एक उपन्यास दूसरे चरण की पहचान की. Neuroinflammation के एक multiphasic घटक के ये महत्वपूर्ण निष्कर्ष तर्कसंगत एससीआई के लिए दोनों सेल आधारित और औषधीय हस्तक्षेप सहित चिकित्सकीय उपचार कार्यनीतियों के डिजाइन और कार्यान्वयन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है.

OptiPrep ढाल प्रणाली ⁹ खून में कोशिकाओं, सेल संस्कृति ¹⁰ प्रयोजनों के लिए मस्तिष्क से या शुद्ध न्यूरॉन्स से किया गया है अलग मलबे के लिए इस्तेमाल किया, तथापि, हम संशोधित और इस विधि प्रणाली को उन्नत करने के लिए रीढ़ की हड्डी अलग कोशिकाओं से माइलिन मलबे से अलग है, और अनुमति दी प्रवाह cytometry द्वारा सेलुलर सूजन के तेजी से और अधिक सटीक मात्रा का ठहराव. इस cytometry प्रवाह के साथ साथ विधि सीएनएस चोट या रोग की स्थिति के बाद सूजन अनुसंधान में महत्वपूर्ण प्रगति प्रदान के रूप में सबसे अधिक अध्ययन केवल morphological और histological तकनीक है कि सेल प्रकार विशिष्ट हैं या नहीं सच नहीं प्रदान कर सकते हैं हमेशा उपयोग CNS में सेलुलर सूजन की विशेषता है की संभावना है मात्रात्मक निर्धारण. इसके अलावा, कुछ हाल ही के अध्ययन घायल रीढ़ की हड्डी में ताजा dissociated कॉर्ड ^11,12 ऊतक या Percoll ढाल प्रणाली ¹³ द्वारा अलग कक्षों का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिरक्षा कोशिकाओं यों का प्रयास किया है, तथापि, इन अध्ययनों या तो कम सेल पैदावार का प्रदर्शन किया है या असंवेदनशील प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने.

इसके विपरीत, पहली बार के लिए OptiPrep ढाल सेल तैयारी विधि प्रदान की गई है, संवेदनशील और विश्वसनीय प्रवाह cytometry द्वारा मात्रात्मक वर्गीकृत चोट की गंभीरता के लिए प्रतिक्रिया में और 180 में डीपीआई एक विस्तारित timecourse पर सेलुलर सूजन के परिवर्तन करने के लिए मूल्यांकन. और प्रवाह cytometric विश्लेषण की संवेदनशीलता और विश्वसनीयता भी विशिष्ट प्रतिरक्षा सेल प्रकार का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की विशिष्टता पर निर्भर करती है, प्रवाह cytometry के रूप में रूपात्मक मापदंड और सेल प्रकार का भेद करने के लिए की अनुमति नहीं देती. PMNs, मैक्रोफेज / microglia या टी बताता के लिए एंटीबॉडी की विशिष्टता प्रवाह cytometry में किया गया है अच्छी तरह से peritoneal PMNs और वायुकोशीय मैक्रोफेज संस्कृति और कोशिकाओं में घायल रीढ़ ^की हड्डी ऊतक 1,2 में परीक्षण किया गया. OptiPrep ढाल प्रणाली के साथ साथ, इन प्रवाह cytometry के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी सेलुलर सूजन के एक लौकिक और मात्रात्मक विश्लेषण है कि एससीआई microenvironment की गतिशीलता में नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है, और पहले एक विस्तारित multiphasic प्रतिक्रिया समय के लिए पहचान की पीढ़ी के लिए योगदान दिया है सेलुलर सूजन के. एससीआई के बाद कक्षों की यह multiphasic प्रतिक्रिया महत्वपूर्ण हो सकता है के लिए विशेष सेल प्रकार के चोट के बाद किसी विशिष्ट समय पर उपस्थित की भूमिका की जांच के लिए या विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं है कि चोट बढ़ सकता है के खिलाफ उपचारात्मक उपायों उत्पन्न हो सकता है. इसके अलावा, इन निष्कर्षों एससीआई के लिए इष्टतम दवा या सेल आधारित हस्तक्षेप के लिए एक उचित तर्क के विकास में सहायता कर सकते हैं.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
OptiPrep	Fisher Scientific	NC9182490
HBSS	Sigma	H1387
Rabbit anti-rat PMN (FITC)	Accurate Chemical & Scientific	AIFAD51140
Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488)	AbD Serotec	MCA341A488
Mouse anti-rat CD3 (FITC)	AbD Serotec	MCA772F
Trypsin	Sigma	T9935
Collagenase	Sigma	C5138
DME	Sigma	D1152
MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488)	AbD Serotec	MCA1209A488
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30070.03
Rabbit serum	Jackson ImmunoResearch	011-000-120011-000-120
Mouse serum	Jackson ImmunoResearch	015-000-120
Cell Strainer	BD Falcon	352340