लाइव चूहा cortical न्यूरॉन्स में mitochondrial झिल्ली संभावित और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के निर्धारण

Summary

हम प्रतिदीप्ति सूचक, TMRM के आवेदन का प्रदर्शन, cortical न्यूरॉन्स के लिए एक विशेष प्रोत्साहन के आवेदन से पहले और बाद में TMRM प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन सापेक्ष निर्धारित. हम भी प्रतिदीप्ति जांच एच के आवेदन शो<sub2></sub> Cortical न्यूरॉन्स में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के रिश्तेदार स्तर का आकलन DCF-महंगाई भत्ते.

Abstract

Mitochondrial membrane potential (ΔΨm) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of ΔΨm renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine ΔΨm and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria.

Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine Δψm in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H₂DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess ΔΨm or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of ΔΨm or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of ΔΨm or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H₂DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H₂O₂. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in ∆Ψm and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

Protocol

1. सेल संस्कृति Cortical न्यूरॉन्स को अलग कर रहे हैं और पहले से वर्णित तकनीकों और एक गिलास नीचे (MatTek निगम, Ashland, एमए) पाली-D-lysine और laminin 1 के साथ लेपित के साथ संस्कृति बर्तन पर चढ़ाया का उपयोग बड़े हो. 2. फ्लोरोसेंट जांच TMRM और एच डीसीएफ डीए 2 के लिए शेयर समाधान तैयारी निर्जल dimethylsulfoxide के 1 मिलीलीटर में TMRM के 5.0 मिलीग्राम भंग करके एक 10 मिमी TMRM का जायजा समाधान तैयार करें. यह भंवर 1 मिनट के लिए. फिर, aliquots बनाने के लिए और उन्हें -20 ° सी में दुकान है, प्रकाश से बचाने के लिए, और एक महीने के भीतर का उपयोग करें. अगला, निर्जल DMSO के 1 मिलीलीटर में 2 एच डीसीएफ डीए के 4.87 मिलीग्राम भंग करके एक 10 मिमी डीसीएफ 2 डीए एच के शेयर समाधान तैयार करते हैं. इसी तरह, भंवर 1 मिनट के लिए. फिर, aliquots बनाने के लिए और उन्हें -20 ° सी में दुकान है, प्रकाश से बचाने के लिए, और एक सप्ताह के भीतर उपयोग. 3. लोड हो रहा है TMRM और एच 2 डीसीएफ डीए के साथ चूहे cortical न्यूरॉन्स TMRM potentiometric, सेल पारगम्य फ्लोरोसेंट सूचक है कि mitochondria के अत्यधिक नकारात्मक आरोप लगाया इंटीरियर में जम जाता है. यह महत्वपूर्ण है TMRM की कम मात्रा (10-50 एनएम रेंज) का उपयोग करने के लिए ऑटो mitochondrial TMRM के शमन से बचने के. फिर, TMRM के प्रतिदीप्ति संकेत सीधे भीतर mitochondrial झिल्ली भर ΔΨm सह से संबंधित हो सकता है. ΔΨm का नुकसान mitochondria प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप से रिसाव TMRM का कारण बनता है. एच डीसीएफ डीए 2 esterases द्वारा intracellular सेल पारगम्य डीसीएफ डीए में परिवर्तित जांच, और फ्लोरोसेंट डीसीएफ में ऑक्सीकरण परिणाम है. 2 एच के अंतिम एकाग्रता डीसीएफ डीए 2-10 सुक्ष्ममापी और यह के बीच पर्वतमाला अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से प्राप्त न्यूरॉन्स में empirically परीक्षण किया जाना चाहिए के बाद से उच्च लोड हो रहा है सांद्रता 2 एच 2 हे के अभाव में भी डीसीएफ प्रतिदीप्ति के संतृप्ति में परिणाम हो सकता है . किसी भी अंतर्जात या exogenous ऑक्सीडेंट की उपस्थिति (उदाहरण के लिए, नाइट्रिक ऑक्साइड, हाइड्रोजन पेरोक्साइड) डीएफसी प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि होगी. नीचे, हम TMRM और एच 2 डीसीएफ डीए के साथ चूहे cortical न्यूरॉन्स लोड करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं . टीबी:: 145 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी ग्लूकोज, 1.5 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, और 10 TMRM के साथ चूहे cortical न्यूरॉन्स को लोड करने के लिए, पहले, सभ्य न्यूरॉन्स Tyrode बफर (पाठ ओवरले के साथ 3 बार धो मिमी HEPES, 7.4 पीएच NaOH) के साथ समायोजित. फिर, 10 मिमी TMRM शेयर टीबी में 1 / 1000 बार गिराए TMRM के 20 एनएम तैयार है और तब जोड़ने टीबी के 1 मिलीलीटर प्रति पतला TMRM के 2 μl. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 45 मिनट के लिए TMRM साथ न्यूरॉन्स सेते हैं. 45 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के मंच पर संस्कृति डिश माउंट और इमेजिंग शुरू. डीसीएफ 2 डीए एच के साथ चूहे cortical न्यूरॉन्स लोड करने के लिए, सभ्य न्यूरॉन्स टीबी के साथ 3 बार धो लो. अगला, 10 मिमी टीबी में एच 2 डीसीएफ डीए शेयर 1 / 10 गिराए से एच 2 डीसीएफ डीए के 2 सुक्ष्ममापी तैयार करने और फिर पतला एच 2 टीबी के 1 मिलीलीटर प्रति डीसीएफ डीए के 2 μl जोड़ने. फिर, एच डीसीएफ डीए 2 के साथ कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए अंधेरे में न्यूरॉन्स सेते हैं. 45 मिनट के बाद, न्यूरॉन्स के लिए छवियों को प्राप्त करने से पहले अतिरिक्त फ्लोरोसेंट सूचक हटाने टीबी के साथ 4 बार धो लो. 4. TMRM साथ incubated ΔΨm निर्धारित न्यूरॉन्स की इमेजिंग लाइव TMRM, लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (पाठ ओवरले: LSM 510, कार्ल Zeiss इंक) के साथ incubated न्यूरॉन्स के रहते इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए जीना कार्यक्रम समय – श्रृंखला के आवेदन के साथ, प्रयोग किया जाता है. कम संकल्प और तनु लेजर (: कम संकल्प: 256 x 256, लेजर शक्ति: पाठ ओवरले 1%) शक्ति लागू करने के लिए छवियों को प्राप्त करने और photobleaching से बचने के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए. . अगले, घुड़सवार TMRM परिलक्षित प्रकाश का उपयोग करने के साथ भरी हुई न्यूरॉन्स के ध्यान को समायोजित. पर रोशनी 514 एनएम और 570 एनएम का पता लगाने के द्वारा TMRM प्रतिदीप्ति जांच. संतृप्ति स्तर के नीचे सिर्फ एक कैमरा का पता लगाने के लाभ सेट. सभी पैरामीटर, जो संकल्प, शक्ति लेजर, एक कैमरा का पता लगाने के लाभ, और समय चूक अंतराल शामिल प्राप्त करने के एक बार छवियों को सेट कर रहे हैं, प्रयोगों के बीच इन सेटिंग्स को बदलने नहीं है. अगला, क्षेत्र बदल जाते हैं. छवियों एकत्रित शुरू करो. ΔΨm में परिवर्तनों का परीक्षण करने के लिए, 1 FCCP या 2 μg / oligomycin के मिलीलीटर, सुक्ष्ममापी जैसे उत्तेजनाओं, लागू किया जा सकता है जो काफी बिगाड़ना या hyperpolarize mitochondrial झिल्ली की क्षमता, क्रमशः. इन परिवर्तनों TMRM प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक FCCP के मामले में आधारभूत प्रतिदीप्ति तीव्रता, या TMRM oligomycin के मामले में प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि के साथ तुलना में कमी से परिलक्षित होगा. 5. एच 2 डीसीएफ डीए के साथ incubated ROS निर्धारित न्यूरॉन्स की लाइव इमेजिंग 2 डीसीएफ डीए, पहले एच के साथ incubated न्यूरॉन्स के रहते इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, एक खुर्दबीन के मंच पर संस्कृति डिश माउंट. कक्षों की हमें ध्यान केंद्रित समायोजितआईएनजी प्रकाश परिलक्षित. 488 एनएम पर उत्तेजना और 515 एनएम उत्सर्जन द्वारा डीसीएफ प्रतिदीप्ति जांच करते हैं. अगले 5-7%, डिटेक्टर लाभ, और 256 256 x के संकल्प के लिए लेजर बिजली समायोजित करें. प्रयोगों के बीच इन सेटिंग्स को बदलने के मत करो. फिर, रहते समय श्रृंखला प्रोग्राम का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करने के लिए आवृत्ति सेट. एक नए क्षेत्र का चयन करें और छवियों को प्राप्त शुरू. ROS स्तर में परिवर्तन का पता लगाने के लिए, एच 2 हे 2 100-200 सुक्ष्ममापी के साथ कोशिकाओं का इलाज. यह डीसीएफ प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक आधारभूत स्तर के साथ तुलना में वृद्धि से परिलक्षित होगा. 6. डेटा विश्लेषण ब्याज के क्षेत्र (पाठ ओवरले: आरओआई) का प्रयोग करें LSM कार्यक्रम से उपकरण के लिए क्षेत्रों का चयन. फिर, TMRM या ROS प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने. Mitochondrial क्षेत्रों या imaged TMRM या ROS प्रतिदीप्ति तीव्रता, क्रमशः उपाय कोशिकाओं में पूरे सेल शरीर से ROIs से ROIs का चयन करें. TMRM के लिए या प्रत्येक समय बिंदु के लिए सभी ROS के लिए imaged कोशिकाओं के लिए पूरे सेल शरीर से प्रत्येक कोशिका के सभी ROIs से औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना. क्षेत्रों कोशिकाओं को पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना का चयन करें. कई माप ले लो और औसत पृष्ठभूमि की तीव्रता की गणना. हर बार Microsoft Excel का उपयोग बिंदु के लिए प्रत्येक कक्ष में ROIs के औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता से औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता घटाएँ. पृष्ठभूमि तीव्रता subtracting के बाद, इस सूत्र (ΔF = एफएफ ओ / एफ एक्स ओ 100, जहां F = किसी भी समय बिंदु पर प्रतिदीप्ति तीव्रता = आधारभूत प्रतिदीप्ति के लिए पाठ ओवरले) का उपयोग आधारभूत प्रतिदीप्ति TMRM या डीसीएफ प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्य फिर, सिग्मा प्लॉट प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए समय पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन दिखा साजिश उत्पन्न. 7. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1A TMRM साथ incubated चूहा cortical न्यूरॉन्स की एक प्रतिदीप्ति छवि दिखाता है. FCCP के अलावा, एक mitochondrial uncoupler, mitochondrial विध्रुवण और TMRM प्रतिदीप्ति तीव्रता (छवि 1B) का एक नुकसान की ओर जाता है है. आधारभूत TMRM प्रतिदीप्ति स्तर FCCP के अलावा (चित्र 1C पहले 350 सेकंड) से पहले स्थिर बनी हुई है. समय पर TMRM प्रतिदीप्ति परिवर्तन के मात्रात्मक विश्लेषण FCCP (छवि 1C) के अलावा के बाद एक TMRM प्रतिदीप्ति में महत्वपूर्ण कमी से पता चलता है. चित्रा 1D चूहा cortical डीसीएफ के साथ भरी हुई न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति छवि से पता चलता है. एच 2 हे 2 परिणाम के अलावा सेल शरीर में डीसीएफ प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हुई है (छवि 1E). आधारभूत डीसीएफ प्रतिदीप्ति स्तर अपरिवर्तित एच 2 2 हे के आवेदन से पहले (पहले 120 सेकंड) . डीसीएफ प्रतिदीप्ति का समय चूक माप इसके स्थिर स्तर दिखाने के लिए, जो एच 2 हे 2 उपचार (छवि 1F) के बाद वृद्धि हुई है . चित्रा 1 mitochondrial झिल्ली क्षमता और जीना चूहे cortical न्यूरॉन्स में ROS स्तर का मूल्यांकन. (ए) प्रतिनिधि cortical न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति छवि TMRM के साथ भरी हुई है. आधारभूत TMRM प्रतिदीप्ति स्कैनिंग के बाद, न्यूरॉन्स protonophore FCCP (1 सुक्ष्ममापी) के साथ इलाज किया गया. सही करने के लिए चमकीले पीले और काले प्रतिनिधित्व अधिकतम और न्यूनतम तीव्रता, क्रमशः के साथ TMRM प्रतिदीप्ति के pseudocolor तीव्रता बार है. mitochondrial क्षेत्रों से TMRM प्रतिदीप्ति के नुकसान FCCP उपचार (पैनल बी) पर ΔΨm के पतन को इंगित करता है. TMRM प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन के अलग अलग समय बिंदुओं पर मात्रात्मक प्रतिनिधित्व FCCP उपचार के पहले और बाद में पैनल सी. (डी) में चूहे cortical H2DCF – डीए के साथ भरी हुई न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति छवि दिखाया गया है. आधारभूत डीसीएफ प्रतिदीप्ति निर्धारण के बाद, कोशिकाओं 200 सुक्ष्ममापी 2 एच ओ 2 के साथ इलाज किया गया, और डीसीएफ प्रतिदीप्ति में परिवर्तन मूल्यांकन किया गया था. डीसीएफ प्रतिदीप्ति में वृद्धि एच 2 हे 2 उपचार (ई) पर ROS स्तर में वृद्धि को दर्शाता है. डीसीएफ प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के मात्रात्मक विश्लेषण, एच 2 हे 2 उपचार के पहले और बाद में, पैनल एफ स्केल पट्टी में = 10 सुक्ष्ममापी दिखाया गया है Video.7.1 – labmedia 2704_Joshi.avi पहले और बाद FCCP 40x उद्देश्य का उपयोग इसके अलावा cortical न्यूरॉन्स में TMRM सेल इमेजिंग जीते. pseudocolor तीव्रता अधिकतम (FCCP इसके अलावा पहले चमकीले पीले रंग) से पता चलता है और (लाल रंग, FCCP इसके अलावा के बाद) TMRM FCCP अलावा के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता कम है. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के वीडियो. 7.5 – labmedia 2704_Joshi.avi एच 2 हे 2 40x उद्देश्य का उपयोग करने के अलावा पहले और बाद डीसीएफ के cortical न्यूरॉन्स में सेल इमेजिंग जीते. आधारभूत डीसीएफ प्रतिदीप्ति सेल शरीर में हल्के हरे रंग का है और H2O2 के अलावा डीसी बढ़ जाती हैएफ चमकीले हरे रंग प्रतिदीप्ति तीव्रता. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के

Discussion

हम एक कदम-by-कदम का वर्णन कैसे चूहे cortical फ्लोरोसेंट संकेतक TMRM और ₂ एच डीसीएफ डीए, क्रमशः का उपयोग कर न्यूरॉन्स में ΔΨm और ROS निर्धारित करने के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत किया है. अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए, यह महत्वपूर्ण है empirically अंतिम लोड हो रहा है _और TMRM या एच 2 डीसीएफ डीए के लिए समय एकाग्रता का निर्धारण. सामान्य में, 20-200 एनएम से TMRM सांद्रता रेंज, और TMRM के साथ सेल ऊष्मायन समय 20 से 60 मिनट के लिए बदलता है. ₂ एच के अंतिम डीसीएफ डीए एकाग्रता 2-10 सुक्ष्ममापी से पर्वतमाला है, और एक लोड हो रहा है इस सूचक युक्त समाधान में कोशिकाओं के ऊष्मायन 30-45 मिनट से भिन्न होता है है.

यह लेजर और छवियों को लेने के लिए कोशिकाओं प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन (TMRM प्रतिदीप्ति की चंचल उदाहरण के लिए) और किसी भी प्रोत्साहन के अभाव में दोनों फोटो विषाक्तता से बचने के स्कैन गति, शक्ति का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. अनुकूलित ऑप्टिकल सेटिंग्स एक प्रतिदीप्ति संकेत है कि अधिक या कम संतृप्त (दहलीज) उत्तेजना के अभाव में नहीं है में परिणाम चाहिए. एक विशेष लेजर शक्ति और एक स्कैन गति पर एक चयनित क्षेत्र से छवियों को इकट्ठा करने के लिए इष्टतम स्थितियों जब वहाँ रहते इमेजिंग के 10-15 मिनट के लिए किसी भी प्रोत्साहन के अभाव में जांच के प्रतिदीप्ति तीव्रता में कोई बदलाव नहीं कर रहे हैं प्राप्त कर रहे हैं.

अन्य प्रतिदीप्ति ΔΨm निर्धारित जांच rhodamine 123 और टेट्रा मिथाइल rhodamine एथिल एस्टर (TMRE) शामिल हैं. हालांकि, वे पृथक mitochondria ² में श्वसन प्रक्रिया को बाधित पाया गया . महत्वपूर्ण बात, TMRM कम ² सांद्रता में mitochondrial श्वसन पर कोई प्रभाव नहीं है और कम phototoxicity और अन्य जांच के साथ तुलना ^में 3 photobleaching है . एच डीसीएफ डीए ₂ ROS के लिए एक अच्छा संकेत है, क्योंकि यह अच्छी तरह से कोशिकाओं में बनाए रखा है और कई ऑक्सीडेंट प्रजातियों peroxides रूप में, सुपर आक्साइड, ^और नाइट्रिक ऑक्साइड 4 पहचानता है.

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
NbActive4	BrainBits	NbActive4
TMRM	Invitrogen	T668
H2DCF-DA	Invitrogen	C400
NaCl	Sigma	S6191
KCl	Sigma	P3911
CaCl2•2H2O	Sigma	C3306
MgCl2•6H2O	Sigma	M2670
D-Glucose	Sigma	G6152
HEPES	Invitrogen	15630