Hücreler stellat Yedi Adımda
Summary
Burada fare karaciğer hepatik stellat hücrelerin izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Stellat hücre saflaştırma için, fare ciğeri sindirilir<em> In situ</em> Ve<em> In vitro</em> Yoğunluk gradiyenti santrifüj önce pronase kollajenaz tedavi. Bu teknik son derece saf hepatik stellat hücreler elde edilir.
Abstract
Karaciğer yıldız gibi morfoloji stellat hücreleri, karaciğer yerleşik hücreleri ve karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ve hepatositlerde 1,2 arasında Disse bir boşluk bulunmaktadır . Stellat hücreler, kemik iliği öncüleri türetilen ve toplam vücut A vitamini 1, 2% 80 kadar mağaza vardır . Stellat hücrelerin aktivasyonu üzerine, böylece karaciğer fibrozu 3 katkıda miyofibroblastlar içine ekstraselüler matriks üretmek için ayırt. Sözleşme yeteneklerini dayanarak, miyofibroblastik stellat hücreleri, portal hipertansiyon 4 ile ilişkili vasküler tonunu ayarlayabilir . Son zamanlarda, hepatik stellat hücreler güçlü antijen sunan hücreler ve NKT hücrelerinin yanı sıra, geleneksel T lenfositleri 5 etkinleştirebilirsiniz gösterdi.
Burada, fare karaciğer hepatik stellat hücrelerinin etkin bir şekilde hazırlanması için bir yöntem mevcut. Perisinüzoidal yerelleştirme nedeniyle, hepatik stellat hücreler izolasyonu çok adımlı bir süreçtir. Stellat hücreler Disse uzay izolasyon erişilebilir kılmak için, fare ciğeri, sindirim enzimleri Pronase E ve kollajenaz P. ardından perfüzyon ile in situ perfüze olan, karaciğer doku Pronase E ve kollajenaz P ile ek enzimatik muameleye tabi tutulur in vitro. Daha sonra, bu yöntem büyük miktarda A vitamini depolama hepatik stellat hücreler lipid damlacıkları yararlanır. Bu özellik,% 8 Nycodenz degrade santrifüj diğer karaciğer hücre tipleri stellat hücrelerin ayrılmasını sağlar. Burada açıklanan protokol stellat hücreler son derece saf ve homojen bir nüfus verir. Hazırlıkları Saflık floresan mikroskobu veya flow sitometri analizi öncesinde marker molekül glial fibriller asidik protein (GFAP), boyama ile tespit edilebilir. Ayrıca, ışık mikroskobu, yüksek miktarda lipid damlacıklarının limanı yıldız şeklinde hepatik stellat hücreler benzersiz bir görünüm ortaya koymaktadır.
Birlikte ele alındığında, biz temsilcisi morfolojik görünüm görüntüleri ve stellat hücre varlık tanımlamak için yardımcı GFAP ifade de dahil olmak üzere hepatik stellat hücreler, verimli izolasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut.
Protocol
Discussion
Karaciğer stellat hücreler karaciğer temel fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri düzenler. Ayrıca, stellat hücreler karaciğer bağışıklık yanıtının önemli bir bileşeni render, antijen sunan özelliklere sahip. Hepatik stellat hücreler karaciğer toplam hücre sayısı% 10-15 oluşturan rağmen, bu hücrelerin izolasyonu Disse perisinüzoidal uzayda lokalizasyonuna nedeniyle zordur.
Burada yerinde sindirim ve sonraki gradient santrifüj fare ciğeri hepatik stella…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Smith Aile Biyomedikal Araştırma ve NIH RO1 AI083426-01 (FW) Mükemmellik Ödülü tarafından finanse edildi. Patrick Maschmeyer ve Melanie Flach Boehringer Ingelheim Vakfı doktora bursları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name Of Reagent | Company | Catalog No. |
|---|---|---|
| 70μm Cell Strainer | BD | 352350 |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 |
| Collagenase P | Roche | 11249002001 |
| DMEM | Gibco | 11960 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv |
| EGTA | Fluka | 3777 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 |
| HEPES | Gibco | 15630 |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | HV-7523-70 |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 |
| Silicone Tube | Masterflex | HV-96440-14 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD | 353108 |
| Winged Infusion Set | Terumo | 1SV27EL |
References
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. i. s. t. o. r. y. heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &. a. m. p. ;. a. m. p., Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e. Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
