Система для культивирования Ирис пигмента эпителиальных клеток по изучению регенерации линз в Ньют

Summary

В тритон, объектив всегда восстанавливает из спинной диафрагмы по трансдифференцировки радужной оболочки пигментированных эпителиальных клеток (ИПЭС). Здесь мы опишем процедуру культуры спинной и брюшной тритон IPE клеток и их имплантации в глаз тритона. Имплантированные клетки затем изучали срезов тканей и иммуногистохимии.

Abstract

Саламандры, как тритонов и аксолотля обладают способностью к регенерации многие из утраченных частей тела, таких как конечности, хвост с спинного мозга, глаз, мозга, сердца, челюсти ^1. В частности, тритоны являются уникальными для его способность регенерации линзы. После удаления хрусталика, IPE клетки спинного диафрагмы transdifferentiate в объектив клетки и в конечном итоге образуют новый объектив примерно через месяц ^2,3. Это свойство регенерации никогда не выставлялись на вентральной клетки радужной оболочки. Регенерации потенциал клетки диафрагмы могут быть изучены путем трансплантации в пробирке культурный IPE клеток. Для культуры, спинной и брюшной диафрагмы клетки впервые выделен из глаз и культурный отдельно по времени в течение 2 недель (рис. 1). Эти культивируемые клетки являются reaggregated и имплантировали обратно тритона глаз. Прошлые исследования показали, что спинной reaggregate сохраняет свои линзы формирования мощности в то время как совокупный вентральной не образует линзы, сводный, таким образом, в процессе естественных условиях (рис. 2) ^4,5. Эта система определения регенерации потенциал спинной и брюшной клетках диафрагмы очень полезна при изучении роли генов и белков, участвующих в регенерации линзы.

Protocol

1. Ирис культуре клеток Сбор глазных яблок с 7 тритоны (под наркозом в 0,1% этил-3-аминобензоат метансульфоновая кислоты, полученной в PBS) и поместить в свободный кальций магний Хэнкс решение (CMF). Изменение перчатки и работать в капот культуры ткани. Стерилизовать глазные яблоки в Lugol's-этанола в течение 3 секунд. Мыть 2 раза в CMF. Передача глаза Хэнкс и начать вскрытие. Рассеките радужной оболочки роговицы сложных и удалить нейронных сетчатки. Передача комплексов в новое блюдо из Хэнкс. Использование № 15 скальпеля, отдельных комплексов в спинной и брюшной части. Удалите диафрагму фрагментов (вентральной первый) и поместить в посуду, содержащую 1 мл L-15. Добавить 15% (150 мкл) объема dispase (7,5 ед / мл концентрации). Инкубировать при 27 ° С в течение 2 часов (обернуть блюдо с парафильмом). Изолировать IPE клетки стромы (Место раствора трипсина при 27 ° С). Сбор IPE клеток в 1,5 мл трубки. Центрифуга при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре (комнатной температуры) в течение 2 минут, удалите супернатант. Промыть 1 мл Хэнкс и центрифуге при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 2 минут, удалите супернатант. Добавьте 1 мл раствора трипсина, инкубировать в течение 2 часов при 27 ° C. Центрифуга при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 2 минут, удалите трипсина. Добавить 1 мл L-15 мыться, центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 2 минут. Добавить 800 ул L-15, пипетка медленно вверх и вниз, ~ 10 раз (более чем в 12 раз снижает приверженность лечению). Пластина IPE клеток на 24 и коллагена покрытием пластины и инкубировать при 27 ° С в течение 2 недель (как правило, 4 спинных и 4 вентральной скважин получены от 7 тритоны). На данном этапе клетки пригодны для трансфекции генов или лечение факторов, чтобы определить их роль в стимулировании или препятствий регенерации линзы. 2. Агрегация клеток Iris Для чашки, содержащие клетки диафрагмы добавить 20 мкл dispase решение до 400 мкл среды, вихрем мягко. Инкубируйте пластин при 27 ° С в течение ночи. Внесите мягко вверх и вниз, чтобы сместить клетки Место клеток в Эппендорф трубки и спина в течение 2 минут при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Удаление средних и мыть добавлением 1 мл полной L-15, спина 2 минут при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре, удалите среды. Используйте 2000-7000 клеток в совокупности. Добавить 200 мкл L-15 в совокупности в каждую пробирку. Разбить ячейки (200 мкл) в новые трубы Эппендорф. Спиновые при 1000 оборотов в минуту в течение 2 мин при комнатной температуре. Инкубируйте в течение 48 часов при 27 ° C. 3. Имплантация Aggregrated Клетки Сделайте разрез в роговице глаза тритона и снять линзы. После удаления хрусталика, место IPE агрегатную ячейку чуть ниже роговицы на брюшной стороне глаза. Тритоны хранятся в течение месяца, чтобы позволить им регенерации линзы. 4. Вложение Ньют глаз Удалить тритон глаза имплантировали совокупности и поместить его в фосфатным буферным раствором (PBS). Зафиксируем в 4% параформальдегида при 4 ° С в течение по крайней мере 4 часа или на ночь. Стирать в PBS, 4 ° С в течение 30 минут. Относитесь к нему с 0,85% физиологического раствора: 4 ° C, 30 минут. Стирать в Соленые / этанол (1:1): RT в течение 15 минут. Стирать в 70% этанола: РТ, 15 минут. Повторяйте это раз. Стирать в 85% этанола и 95% этанола при комнатной температуре 30 минут каждый Стирать в 100% этанола: РТ, 30 минут. Повторяйте это раз. Хранить при температуре 4 ° С или продолжить. Стирать в 100% ксилола: РТ, 30 минут. Повторяйте это раз. Лечить ксилолом / парафина (1:1): 60 ° C, 45 минут. Лечить со 100% парафина: 60 ​​° C, 20 минут. Повторите это еще два раза. Добавить в вложение пресс-форм. 5. Секционирование Подготовка 15 мкм участков глаза, используя встроенный микротоме. Место глаз разделы по желатин покрытием слайд-шоу и оставить его на слайд теплее. 6. Окрашивание Место слайды в ксилоле в течение 10 минут. Повторите это еще раз. Гидратов в: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% этанола в течение 1 минуты каждый Промойте в воде DI ни на минуту. Стирать в PBS в течение 15 минут. Стирать в PBST (0,2% Triton-X 100 в PBS) в течение 15 минут. Стирать в PBS в течение 15 минут. Место в блокировании решения (10% козьего вторичные антитела) в течение часа. Место в первичных антител для ночлега. Вымойте первичных антител в PBS в течение 15 минут. Стирать в PBST в течение 15 минут. Стирать в PBS в течение 15 минут. Место в вторичными антителами в течение 2 часов в темном (1:100 разведения в PBS). Стирать в PBS, PBST и PBS в течение 15 минут, а затем установите. Соблюдайте слайдов под флуоресцентным микроскопом. 7. Представитель Результаты: Эта процедура культивирования тритон лэто клетки были использованы для изучения регенерации потенциал спинной и брюшной IPE клеток. Более того, это также возможно для изучения конкретных генов, которые способствуют механизм регенерации линзы в глаз тритона. Когда клетки культивировали в течение 2 недель (рис. 1) они могут быть трансфицированных генами, чтобы изучить их роль в регенерации линзы. Особый интерес представляют гены, которые могут вызвать вентральной диафрагмы. С вентральной клетки диафрагма не может transdifferentiate на линзы (рис. 2) индуктивной функции генов-кандидатов могут быть изучены. В прошлом, с помощью этой техники мы показали, что, когда шесть-3 была более выраженной в присутствии ретиноевой индукции линзы кислоты наблюдается с брюшной диафрагмы 6. На рисунке 3 мы видим, что совокупные вентральной диафрагмы породил взрослого и дифференцированные объектив (стрелки), не отличается от хоста объектив от спинной диафрагмы (стрелка). Рисунок 1. а) Спинная диафрагма пигментированные эпителиальные клетки культивировали в пробирке в течение 2 недель. б) брюшной диафрагмы пигментированные эпителиальные клетки культивировали в пробирке в течение 2 недель. Обратите внимание, что пигментация сохраняется до этой стадии в обоих спинной и брюшной клетки радужной оболочки. Рисунок 2. Регенерация способность культурный IPE клеток. ) Объектив индукции из спинной IPE совокупности клетки (стрелки). Хост индукции линз из спинной диафрагмы (стрелка), ди: спинной диафрагмы, В. И.: вентральной ирис, ле: объектив эпителия, Л. Ф.: объектив волокон. б) отсутствие индукции линз из вентральной IPE совокупности клетки (стрелки). Хост индукции линз из спинной диафрагмы (стрелка). Рисунок 3. Объективы индукции из вентральной совокупности трансфекции с шестью-3 и обрабатывают ретиноевой кислоты. Хост индукции линз из спинной диафрагмы (стрелка). Объективы индукции из вентральной агрегат (стрелки).

Discussion

Этот протокол установил в пробирке системы для изучения механизмов регенерации линзы у тритонов. Так как агрегаты (либо со спины или вентральной преданно следовать за их поведением в естественных условиях в процессе регенерации эта техника может облегчить огромные усилия, необходимые для трансгенез у тритонов и может быть использовано для усиления функции, а также потеря функции экспериментов ^7,8,9. Кроме того, , агрегатов или ирисы в целом может легко относиться с факторами роста и изучать их влияние, как описано в данном протоколе. Например роль BMP пути изучалась с помощью этой техники ^6.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Lugol’s solution		Sigma	L-6146
HEPES		Sigma	H-4034
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid		Sigma	E-10521
Dispase		Gibco	17105-041
Trypsin 1:250		Gibco	27250018
L-15 ( Leibovitz)		Sigma	L-4386
DNase 1		Sigma	D5025-150KU
Kanamycin Sulfate		Gibco	100x, 15160
FBS		Sigma	F4135
Fungizone (amphotericin B solution)		Sigma	A2942
24 well collagen coated plate		BD biosciences	354408