Bütün hayvanlar MG53-aracılı hücre zarı tamir ve hücresel seviyede dinamik bir süreç görselleştirmek için kullanılan protokoller burada nitelendirdi. Bu yöntemler, plazma zarı mühürlenirken ve rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi araştırmak için uygulanabilir.
Hücre zarının akut yaralanma tamir elemental normal hücresel fizyoloji süreci ve hatalı zarı onarımı, pek çok dejeneratif insan hastalıklara bağlı olmuştur. Membran mühürlenirken makine önemli bir bileşeni olarak MG53 son keşfi, moleküler biyoloji, temel doku onarımı yanı sıra, rejeneratif tıp potansiyel translasyonel uygulamaları için daha iyi bir anlayış sağlar. Burada detaylı MG53 in vivo fonksiyonu olarak izole kas liflerinin içine boya giriş ölçerek ex vivo zarı tamir kapasitesini test etmek için fare modelleri, treadmill egzersiz protokolleri kullanarak kas hasarı tamir keşfetmek ve dinamik bir süreç izlenmesi için deneysel protokolleri kültür hücreleri canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak MG53-aracılı vezikül kaçakçılığı ve hücre zarı onarımı.
Koşu Bandı çalışan tedavi edilen hayvanlar için bir egzersiz yükü sağlayan yararlı bir yöntem. Ölçüm kas fonksiyonu için bir metodoloji ya da dayanıklılık kapasitesi olarak sürekli tekrarlanabilir moda 8 yürütmek zor herkesin bildiği gibi gürültülü bir yaklaşımdır. Genel olarak, yorgunluk kez deney grupları arasında önemli farklılıklar, bazı nakavt fare hatları ve 9 yabani tür fareler arasında bu gibi çözmek için bir bitiş noktası olarak kullanılabilir. Deneysel manipülasyonlar, bazı ilaç denemeleri gibi daha ince fark, üreten, bu tekniği ile ilişkili gürültü üzerinde farklılıkları gidermek olmayabilir. Tekrarlanabilirlik ve duyarlılık bu tekniklerin en üst düzeye çıkarmak için çok yakından oturumunda oturum için gerekli koşulları sağlamak için önemlidir. Gün süre hayvanların yanı sıra kullanılan ısınma dönemi koşulları, icra edildiği önemli faktörlerdir ve deneme yargılanma tutarlı kalmalıdır.
Gerilme etkileri farelerde belirli suşları diğer suşlar daha koşu bandı üzerinde daha fazla zaman aday ve dayanıklılık egzersizi 10 farklı yanıt olarak, koşu bandı protokollerin tasarımı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir . Genel bir kural olarak, birçok farelerin bir yorgunluk çalışmada toplam 200-300 metre koşu bandı hızı (m / m başladıktan sonra her dakika için 1 ile 5 m / m başlangıç hızı) sabit artış ile çalıştırmak mümkün olacaktır. Bir dayanıklılık egzersizi için fareler 30 dakika 2 ya da 3 haftada bir kere, 9 ila 12 m / m arasında çalıştırmak olabilir. Ancak, bireysel çalışmalar, genellikle, deneysel bireysel ihtiyaçlarına uygun protokol bazı optimizasyon gerektirir.
UV lazer hasar prosedürü, iskelet kas lifleri 3,6,11 zarı tamir kapasitesini ölçmek için etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir . Bu deneylerin başarısı için hayati bir bileşendir izlerse düzenli bir desen ve buruşuk görünmüyor düzgün bir sarcolemma ile düz bir çubuk biçimli bir görünüm ekranı yalnızca kas lifleri kullanmaktır. Diğer kas lifleri seçilirse zarı hasarı Bu deneylerin sonuçları bu lifler ve yorumlama zaten mevcut olabilir komplike olabilir. Işınlanmış bölgenin lif ve tanımı yönünü Şekil 1'de tanımlanmış olması da önemlidir. Bu, böylece lifler arasında karşılaştırma izin tekrarlanabilir büyüklükte bir yaralanma sağlar. Yaralanma tanımlanan bölgenin tamamen fiber içinde yer alıyorsa, bir iç yaralanma sarcolemma kesintiye yerine oluşturulur. Ayrıca, mesafe kadar taşınmış / F 0 için hesaplanan değer faiz ortalama floresan ölçümü için seçilen bölge çok hassastır. Yaklaşık 200μm 2, ve yaralanma sitesi de dahil olmak üzere komşu bir alana uygundur. Yaralanma tanımlanan bölgenin aksine, bu alanda fiber içinde tamamen yalan gerekir. Fiber dış mekan eklerseniz, daha ciddi bir fenotip ile liflerinde mesafe kadar taşınmış / F 0 düşürürken, ortaya çıkan boş bir alanı az boya girişi ile lifleri mesafe kadar taşınmış / F 0 artacaktır . Bu testin duyarlılığı azaltır, böylece lifler arasında karşılaştırma daha zor hale.
Mikropipet hasar tahlil için, etkin bir şekilde hücre zarının zarar için mikropipet ve cam alt çanak arasındaki açı yaklaşık 45 derece olmalıdır. Hücreler, yemeğin altına sıkıca bağlı olmalı ve yuvarlak hücreler mikropipet alay sonra ayırmak, büyük olasılıkla bu yana kullanılan olmamalıdır mikropipet hasar için seçilmiştir. Saponin permeabilzation deneyler, penetrasyon testleri mikropipet ile karşılaştırıldığında daha az gerçekleştirmek için teknik olarak zor ve göreceli olarak daha hızlı. Ancak, saponin hasar saponin diffüz ve o çanak diğer hücrelere zarar verir bu yana sadece bir hücre çanak başına kullanılabilir olması da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |