Dominio transmembrana Oligomerización propensión determinada por el ensayo toxR
Summary
Un procedimiento eficaz para evaluar la propensión de oligomerización dominios transmembrana de un solo paso (TTM) se describe. Proteínas quiméricas que consiste en la DTM fundido a toxR se expresan en una cepa de E. coli reportero. TMD inducida por oligomerización causas dimerización de toxR, activación de la transcripción y la producción de la proteína reportera,-galactosidasa.
Abstract
El punto de vista simplista de los dominios transmembrana de la proteína como un mero anclas en bicapas de fosfolípidos desde hace mucho tiempo que ya fueron desbancados. En muchos casos, que atraviesa la membrana las proteínas han desarrollado mecanismos muy sofisticados de acción. 3.1 Una forma en que las proteínas de membrana son capaces de modular sus estructuras y funciones es por contacto directo y específico de las hélices hidrofóbicas, formando oligómeros estructura transmembrana. 4,5 Mucho recientes el trabajo se ha centrado en la distribución de los aminoácidos preferentemente en el medio ambiente de la membrana en comparación con una solución acuosa y las fuerzas intermoleculares diferentes que la asociación de proteínas en coche. 6,7 Sin embargo, los estudios de reconocimiento molecular en el dominio transmembrana de las proteínas aún por detrás de los de soluble en agua las regiones. El principal obstáculo sigue siendo: a pesar de la especificidad y afinidad notable que oligomerización transmembrana puede lograr, 8 medición directa de su asociación es un reto. Las metodologías tradicionales aplicadas al estudio de la función integral de proteína de la membrana puede ser obstaculizada por la insolubilidad inherente de las secuencias en estudio. Puntos de vista biofísico adquiridos al estudiar péptidos sintéticos que representan los dominios transmembrana puede proporcionar una visión estructural de utilidad. Sin embargo, la importancia biológica de las micelas de detergente o de los sistemas de liposomas utilizados en estos estudios para imitar las membranas celulares con frecuencia se cuestiona, no adoptar una estructura de péptidos nativos-como en estas condiciones y que su comportamiento funcional, reflejen verdaderamente el modo de acción dentro de una membrana nativa ? Con el fin de estudiar las interacciones de las secuencias transmembrana en bicapas de fosfolípidos naturales, el laboratorio Langosch desarrollado ensayos toxR transcripcional reportero. 9 El dominio transmembrana de interés se expresa como una proteína quimérica con la proteína de unión a maltosa para la ubicación de la periplasma y toxR que presente un informe del nivel de oligomerización (Figura 1).
En la última década, varios otros grupos (por ejemplo, Engelman, DeGrado, Shai) optimizado y aplicado este reportero de ensayo toxR. 10-13 Los ensayos toxR varios se han convertido en un estándar de oro para probar interacciones proteína-proteína en las membranas celulares. Nosotros en este documento demuestran una operación típica experimental llevado a cabo en nuestro laboratorio que todo sigue los protocolos desarrollados por Langosch. Este método de aplicación general es útil para el análisis de dominio de transmembrana la libre asociación de E. coli, donde se utiliza β-galactosidasa de producción para evaluar la propensión oligomerización TMD. Al TMD inducida por dimerización, toxR se une al promotor ctx causando la regulación del gen lacZ de β-galactosidasa. Una lectura colorimétrica se obtiene mediante la adición de ONPG a las células lisadas. Escisión hidrolítica de ONPG por los resultados de β-galactosidasa en la producción de la especie que absorbe la luz o-nitrofenolato (ONP) (Figura 2).
Protocol
Discussion
El ensayo toxR reportero de la transcripción es una forma fácil para identificar las secuencias transmembrana con el potencial de oligomerize. Dado que las interacciones se producen dentro de la membrana interna bacteriana, este ensayo se eludan las cuestiones relacionadas con la validez de los sistemas que estudian en la membrana mimética-ambientes. Teniendo en cuenta que la clonación de TTM múltiples en un solo plásmido fácilmente se puede hacer en paralelo y el ensayo completo se puede realizar en formato de 9…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a los Institutos Nacionales de Salud (1R21CA138373 y Stand Up to Cancer (SU2C) para apoyos financieros de este trabajo. HY está agradecido por el premio Elion 2009 de la Asociación Americana de Investigación del Cáncer, el Premio Académico Kimmel de la Fundación Sidney Kimmel para Investigación sobre el Cáncer (SKF-08-101), y el Premio Nacional de Ciencias Facultad de Carrera Temprana Fundación (NSF0954819).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | Teknova | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Chemicals | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercaptoethanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | NEB | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWRI | 89032-204 | |
| Shaking incubator | FormaScientific |
References
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