ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향
Summary
단일 패스 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향 (TMDS)을 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다. ToxR에 융합 TMD 구성된 키메라 단백질은 E. 대장균 기자 스트레인에 표현됩니다. TMD 유도 oligomerization는 ToxR, 해독 및 기자 단백질의 생산, – galactosidase의 활성의 dimerization이 발생합니다.
Abstract
disproven되어 이후 단백질 transmembrane 도메인의 oversimplified 전망은 단순히 인지질의 bilayers의 앵커 오래되었습니다. 많은 경우에 막 – 스패닝 단백질 행동의 고도로 복잡한 메커니즘을 발전시켜 왔습니다. 막 단백질들의 구조와 기능을 조절 할 수있는 1-3 편도는 구조 transmembrane의 oligomers를 형성, 소수성의 나선의 직접적이고 구체적인 접촉하는 것입니다. 4,5 대부분 최근이 작업은 우선적으로 수용액 및 드라이브 단백질 협회. 6,7는 그럼에도 불구하고, 단백질의 transmembrane 도메인에서 분자 인식 연구가 계속 중 그 뒤에 lags하는 다른 분자간 부대 비교 멤브레인 환경에서 발견된 아미노산의 분포에 초점을했습니다 수용성 지역. 주요 장애물은 남아있다 : 놀라운 특이성과 transmembrane의 oligomerization 얻을 수있는 친화력에도 불구하고, 그들의 협회 8 직접 측정은 도전입니다. 통합 멤브레인 단백질 기능 연구에 적용된 전통 방법론은 시험에서 시퀀스의 고유 불용성에 의해 방해하실 수 있습니다. transmembrane 도메인을 나타내는 합성 펩티드를 공부에서 얻은 통찰력 Biophysical 유용한 구조적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그러나 세제 micellar이나 세포 세포막을 모방하는 이러한 연구에 사용되는 리포좀 시스템의 생물 학적 관련은 종종 의문이며 펩티드는 이러한 조건 하에서 원시와 같은 구조를 채택하고 그들의 기능 동작은 진정한 네이티브 막 내에서 동작의 모드를 반영하지 ? 천연 인지질의 bilayers의 transmembrane 시퀀스의 상호 작용을 연구하기 위해 Langosch 실험실 ToxR transcriptional 기자 assays을 개발했습니다. 관심사 9 transmembrane 도메인이 periplasm 및 ToxR에 위치 말토오스 결합 단백질과 키메라 단백질로 표현되는 보고서를 제공하는 oligomerization의 수준 (그림 1).
지난 10 년, 여러 다른 그룹 (예 : Engelman, DeGrado, 샤이)는 더욱 최적화하고 ToxR 기자 분석을 적용. 10-13 다양한 ToxR의 assays는 세포 점막에 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하는 황금 표준이되었습니다. 우리는 여기에 주로 Langosch에 의해 개발된 프로토콜을 따르는 우리 연구실에서 수행 전형적인 실험 작업을 보여줍니다. 이것은 일반적으로 적용되는 방법은 E.에 transmembrane 도메인 자체 협회의 분석에 유용합니다 β – galactosidase 생산이 TMD oligomerization의 성향을 평가하는 데 사용됩니다 대장균. TMD 유도 dimerization시, ToxR은 β – galactosidase에 대한 LacZ 유전자의 최대 규제를 일으키는 CTX업자에 바인딩합니다. colorimetric 판독이 lyzed 세포 ONPG를 추가하여 얻을 수 있습니다. 빛을 흡수 종 O – nitrophenolate (ONP) (그림 2)의 생산에 β – galactosidase 결과에 의해 ONPG의 가수 분해 절단.
Protocol
Discussion
ToxR transcriptional 기자 분석은 oligomerize 수있는 잠재력을 지닌 transmembrane 시퀀스를 식별하는 손쉬운 방법입니다. 상호 작용은 세균 내부 멤브레인 내에서 발생하기 때문에,이 분석은 멤브레인 – 모방 환경에서 공부하는 시스템의 유효성과 관련된 문제를 circumvents. 하나의 플라스미드에 여러 개의 TMDS의 복제가 쉽게 병렬로 할 수 있으며, 전체 분석이 96 – 웰 플레이트 형식으로 진행 될 수 감안할 때,?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 국립 보건원을 (1R21CA138373 감사하고이 작품의 재정 지원을위한 암 (SU2C)에 일어나. HY은을 위해 시드니 킴멀 재단에서 암 연구, 킴멀 학술 상을 미국의 협회에서 2009 Elion 수상에 감사합니다 암 연구 (SKF – 08-101) 및 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 학부 조기 채용 수상 (NSF0954819).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | Teknova | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Chemicals | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercaptoethanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | NEB | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWRI | 89032-204 | |
| Shaking incubator | FormaScientific |
References
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