Summary

Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

Published: June 16, 2011
doi:

Summary

Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.

Abstract

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad mediada por células T autoinmunes. Durante la patogénesis, los pacientes se vuelven cada vez más insulinopenia como la producción de insulina se pierde, probablemente esto se debe a la destrucción de las células beta del páncreas por las células T. Comprensión de los mecanismos de la muerte de las células beta en el desarrollo de DT1 proporcionará información para generar una cura efectiva para esta enfermedad. Mediada por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se han utilizado históricamente el radionúclido cromo 51 (51 Cr) para etiquetar las células diana. Estos objetivos se exponen a las células efectoras y la liberación de 51 Cr de las células diana se lee como una indicación de la muerte celular mediada por linfocitos. Los inhibidores de la consecuencia de muerte celular en menor liberación de 51 Cr.

Como células efectoras, se utilizó una población activa autorreactivos clonal de las células CD8 + linfocitos T citotóxicos (CTL) aislado de un ratón transgénico de valores, tanto para las cadenas alfa y beta del receptor de la célula AI4 T (TCR). Activa las células T AI4 fueron co-cultivadas con 51 Cr células diana marcadas NIT durante 16 horas, la liberación de 51 Cr se registró para el cálculo de lisis específica

Las mitocondrias participar en importantes eventos fisiológicos, tales como la producción de energía, la regulación de la transducción de señales, y la apoptosis. El estudio de las células beta mitocondrial cambios funcionales durante el desarrollo de DT1 es una nueva área de investigación. Utilizando el potencial de membrana mitocondrial colorante tetrametil rodamina éster metílico (TMRM) y confocal de imágenes microscópicas de células vivas, que supervisó el potencial de membrana mitocondrial en el tiempo en la línea de células beta NIT-1. Para los estudios de imagen, las células T efectoras AI4 fueron marcadas con el colorante fluorescente tinción nuclear Picogreen. NIT-1 en las células y las células T fueron co-cultivadas en cubreobjetos y cámaras montadas en la platina del microscopio equipado con una cámara de células vivas, controlada a 37 ° C, con 5% de CO 2, y húmedo. Durante estos experimentos se tomaron imágenes de cada grupo cada 3 minutos durante 400 minutos.

Más de un curso de 400 minutos, se observó la disipación del potencial de membrana mitocondrial en NIT-1, donde grupos de células AI4 las células T se adjunta. En el experimento de control simultáneo donde NIT-1 células fueron co-cultivadas con MHC mal emparejado las células Jurkat de linfocitos, el potencial de membrana mitocondrial se mantuvo intacta. Esta técnica se puede utilizar para observar en tiempo real los cambios en el potencial de membrana mitocondrial en las células bajo el ataque de los linfocitos citotóxicos, citocinas u otros reactivos citotóxicos.

Protocol

1. Preparación de las células Objetivo el cultivo de células: la cultura de las líneas celulares de ratón beta, NIT-1 y NIT-4, fue de 1,2 se ha descrito anteriormente en DMEM suplementado con FBS al 10%, 0,02% de BSA, no de aminoácidos esenciales, 15 mM HEPES, 16,5 mm Glocose y penicilina / estreptomicina. El 51 Cr etiquetado, las células de las semillas en un fondo plano de 96 pocillos placa de cultivo de 5×10 4 células / pocillo en 200 l medio de cultivo. Para los ex…

Discussion

Células T citotóxicas mediadas por muerte de las células beta es la fisiopatología principal de DT1 5. Ensayos de CML con 51 Cr liberación nos permite estudiar el grado de respuesta del efector objetivo 6. Sin embargo, el proceso detallado y las vías de las células T mediada por la muerte de las células beta aún no está totalmente entendido. Dado que las mitocondrias son esenciales para la función celular beta y la muerte de siete, nos hemos centrado en cambios en l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud y DK074656 AI56374 (CEM), así como la Fundación de Investigación de Diabetes Juvenil.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Cr-51 Perkin Elmer NEZ030500IMC  
PBS Cellgro 21-040-60  
Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) Invitrogen T668  
Picogreen Invitrogen P7581  
AI4 mimotope mimotopes.com amino acid sequence: YFIENYLEL  
IL-2 R & D 485-MI  
DMEM Invitrogen 11885  
FBS HyClone SH30071.03  
Bovine Serum Albumin Sigma A8412  
HEPES Cellgro 25-060-Cl  
MEM Non-Essential Amino Acids GIBCO 11140  
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109  
Phenol red-free DMEM Sigma D5303  
CO2 Incubator Thermo Fisher HeraCell 150i Kept sterile for cell culture
Biological safety cabinet Thermo Fisher Forma 1440  
Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass Fisher 14-958-A  
Gamma Counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter  
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta Confocal With motorized stage and live cell chamber
Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) Eppendorf    
Tubes (Amber) Fisher 50819772  
Centrifuge Sorvall Legend RT+ 75004377  
Hemacytometer Fisher Scientific 267110  
Upright Microscope Zeiss Axioskop40  
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice The Jackson Laboratory 004347  
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice The Jackson Laboratory 004348  
NOD-AI4α/ β F1 mice N/A N/A Bred in UF animal facility

References

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Cite This Article
Chen, J., Grieshaber, S., Mathews, C. E. Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (52), e2724, doi:10.3791/2724 (2011).

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