في شبكية هيولي باطني يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي في البروتين والكالسيوم. لقد أنشأنا نظاما التجريبية التي تسمح لنا لمعالجة دور قنوات + CA2 وتسرب لتوصيف آلياتها التنظيمية المفترضة. هذا النظام ينطوي على إسكات الجينات بوساطة سيرنا والخلية الحية CA2 + التصوير.
في خلايا الثدييات ، وشبكية هيولي باطني (ER) يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي البروتين والكالسيوم وكذلك في إشارة 1. وheterotrimeric Sec61 معقدة في الغشاء ER يوفر مسارا مائي لالبروتينية حديثا توليفها في التجويف من لائحة. العمل الأخير من مختلف المختبرات واقترح أن هذا المجمع قد تشكل أيضا heterotrimeric كا عابر 2 + قنوات تسرب 2-8. كانت الملاحظة الرئيسية لهذه الفكرة التي تطلق من البروتينية الوليدة من الريبوسوم والمعقدة التي Sec61 بوروميسين يؤدي إلى الإفراج عابر كا 2 + من لائحة. علاوة على ذلك ، فقد لوحظ في المختبر أن يشارك البروتين اللمعية ER بيب في منع نفاذية أيون على مستوى 9،10 Sec61 المجمع. لقد أنشأنا نظاما التجريبية التي تسمح لنا لمعالجة مباشرة لدور مجمع Sec61 المحتملة كما كا قناة + 2 وتسرب لتوصيف آلياتها التنظيمية المفترضة 11-13. هذا النظام يجمع بين إسكات الجينات بوساطة سيرنا والخلية الحية كا 2 + التصوير 13. تعامل مع الخلايا siRNAs الموجهة ضد الترميز والمنطقة غير المترجمة (UTR) على التوالي ، من الجينات أو SEC61A1 سيرنا السيطرة السلبية. في تحليل تكامل ، هي الخلايا المشترك مع ناقلات transfected IRES – GFP التي تسمح للمقاومة سيرنا التعبير عن الجينات SEC61A1 wildtype. ثم يتم تحميلها على الخلايا التي تحتوي على الكالسيوم ratiometric – 2 + مؤشر FURA – 2 لرصد التغيرات في وقت واحد في عصاري خلوي كا 2 + التركيز في عدد من الخلايا عبر مجهر مضان. القياس المستمر للعصاري خلوي كا 2 + يسمح أيضا لتقييم تأثير عوامل مختلفة ، مثل بوروميسين ، مثبطات جزيء صغير ، وعلى thapsigargin كا 2 + التسرب. هذا النظام التجريبي يعطينا فرصا فريدة لط) تقييم مساهمة مختلف البروتينات إلى غشاء ER السلبي كا 2 + هروب من لائحة في مختلف أنواع الخلايا ، والثاني) توصيف البروتينات والآليات التي تحد من هذا كا 2 + السلبي هروب رأس المال ، و ج) دراسة آثار الطفرات المرض المرتبط في العناصر ذات الصلة.
في خلايا الثدييات ، وشبكية هيولي باطني (ER) يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي البروتين وكذلك في إشارة الكالسيوم. هنا ، وقد وصفت لنا نظام التجريبية التي تسمح لنا للتصدي بشكل مباشر على دور قناة واحدة الكالسيوم + 2 تسرب محتمل لتوصيف وآلياتها التنظيمية المفترضة 13. هذا النظام التجريبي يعطينا فرصا فريدة لط) تقييم مساهمة مختلف البروتينات إلى غشاء ER السلبي كا 2 + هروب من لائحة في مختلف أنواع الخلايا ، والثاني) توصيف البروتينات والآليات التي تحد من هذا كا 2 + السلبي هروب رأس المال ، و ج) دراسة آثار الطفرات المرض المرتبط في العناصر ذات الصلة.
نلاحظ أنه ينبغي تحليل الخلايا الوحيد القابل للتطبيق والجدوى الشاملة التي يجب أن تكون فوق 80 ٪. لذلك ، يتم تقييمها بشكل روتيني بقاء الخلية توظيف النووية معرف بقاء الخلية الزرقاء / الخضراء كاشف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. وعلاوة على ذلك ، والتحليل الإحصائي للتغيرات في عصاري خلوي كا 2 + تركيز إلزامي. لذلك ، يجب أن تكون التجارب التي أجريت على أربع دفعات مختلفة من الخلايا وcoverslips مع اثنين لا يقل عن 20 خلايا لديك ليتم تحليلها من أجل كل حالة في تجربة واحدة. نلاحظ أن التجارب المختلفة والتي يتعين الاضطلاع بها في نفس الوقت بعد البذر على زلات الغطاء.
The authors have nothing to disclose.
كان مدعوما من قبل SL الزمالة من DFG (مدرسة عليا للبحوث 845). وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من (530/C1 SFB ول967) DFG وHOMFOR.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
DMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 31966 |
OptiMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 51985 |
FBS | Biochrom | S0115 |
Penicillin/ Streptomycin | PAA | P11-010 |
HiPerFect | Qiagen | 301707 |
Fugene HD | Roche Diagnostics | 04709713 |
Nuclear-ID Blue/Green cell viability reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-53004 |
FURA-2 AM | Invitrogen | F-1221 |
Puromycin | Sigma | P 7255 |
Thapsigargin | Invitrogen | T-7459 |
Ophiobolin A | Enzo Life Sciences | ALX-270-109 |
Trifluoperazine | Sigma | T 6062 |
Countess® Automated Cell Counter | Invitrogen | |
Typhoon-Trio imaging system | GE Healthcare | |
TE2000-S microscope with DS-5Mc camera | Nikon | |
iMIC microscope with polychrome V | Till Photonics |