'Bioluminescent' بالعاثية مراسل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية الفئة أ
Summary
وهناك طريقة بسيطة لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية الأولوية لاستخدام وراثيا مراسل فج. هذه بالعاثية المراسل ، والتي هي محددة لأنواع معينة المضيفة ، قادرة على الاستجابة بسرعة transducing bioluminescent إشارة إلى الخلايا المضيفة. هنا ، نحن تصف استخدام فج مراسل للكشف عن<em> يرسينيا بيستيس</em>.
Abstract
يرسينيا بيستيس وعصيات الجمرة الخبيثة هي الفئة أ مسببات الأمراض البكتيرية التي هي العوامل المسببة للمرض الجمرة الخبيثة والطاعون ، على التوالي 1. على الرغم من الطبيعي حدوث الأمراض على حد سواء "هو الآن نادرة نسبيا ، وإمكانية استخدام هذه الجماعات الإرهابية باعتبارها الاسلحة البيولوجية مسببات حقيقية. بسبب سراية المرض المتأصل ، وبطبيعة الحال السريرية السريع ، وارتفاع معدل وفيات الأطفال ، فمن الأهمية بمكان أن يتم الكشف عن تفشي بسرعة. ولذلك المنهجيات التي توفر الكشف السريع والتشخيص ضرورية لضمان التنفيذ الفوري للتدابير الصحة العامة وتفعيل إدارة الأزمات.
قد المؤتلف بالعاثية مراسل توفير نهج محدد وسريع للكشف عن Y. الطاعون وباء. الجمرة الخبيثة ، ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها في الوقت الحاضر استخدام تحلل بالعاثية الكلاسيكية فحوصات لتحديد أكدت هذه مسببات الأمراض البكتيرية 2-4. هذه المقايسات الاستفادة من طبيعيا بالعاثية التي هي محددة وlytic لمضيفيهم البكتيرية. بين عشية وضحاها بعد نمو للبكتيريا المزروعة في وجود فج محددة ، وتشكيل لويحات (تحلل الجرثومي) يوفر تحديد هوية الهدف البكتيرية. على الرغم من أن هذه القياسات ليست قوية ، فإنها تعاني من ثلاثة عيوب : 1) أنها تقوم المختبرات ؛ 2) أنها تتطلب العزلة البكتيرية وزراعة عينة من المشتبه بهم ، و 3) أنها تأخذ 24-36 ساعة لإكمال. لمعالجة هذه القضايا ، والمؤتلف وراثيا "للضوء الموسومة" فج المراسل من خلال دمج جينات harveyi الضمة luxAB في جينوم Y. الطاعون وباء. الجمرة الخبيثة بالعاثية محددة 5-8. وكان مراسل luxAB الناتجة بالعاثية قادرة على الكشف عن هدفهم محددة بسرعة (في غضون دقائق) ، ومنح بحساسية النمط الظاهري bioluminescent إلى الخلايا المتلقية. الأهم من ذلك ، تم الحصول عليها إما مع الكشف عن خلايا المزروعة المستلم أو وهمية مع المصابين العينات السريرية 7.
لأغراض العرض التوضيحي ، ونحن هنا تصف طريقة للكشف بالعاثية بوساطة من المعروف Y. طاعون عزل باستخدام بالعاثية مراسل luxAB شيدت من فج CDC التشخيص الطاعون ΦA1122 6،7 (الشكل 1). ويمكن استخدام طريقة مماثلة ، مع تعديلات طفيفة (مثل التغير في درجة الحرارة ونمو وسائل الإعلام) ، للكشف عن B. الجمرة الخبيثة العزلات باستخدام B. الجمرة الخبيثة Wβ بالعاثية المراسل : luxAB 8. الأسلوب يصف تنبيغ بالعاثية بوساطة من النمط الظاهري biolumescent المزروعة إلى Y. طاعون الخلايا التي يتم قياسها في وقت لاحق باستخدام luminometer microplate. وتشمل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة على المقايسات بالعاثية تحلل التقليدية هو سهولة الاستخدام ، ونتائج سريعة ، والقدرة على اختبار عينات متعددة في وقت واحد في شكل لوحة microtiter 96 – جيدا.
الشكل 1. الكشف التخطيطي ، وبالعاثية تختلط مع العينة ، وتنميط يصيب الخلية ، وأعرب عن luxAB ، وbioluminesces الخلية. تجهيز العينات ليست ضرورية ، وتنميط وخلايا مختلطة وقياسها في وقت لاحق للضوء.
Protocol
Discussion
هذا الأسلوب يدل على قدرة بالعاثية مراسل لكشف بسرعة Y. يمكن أن الطاعون منذ بالعاثية مراسل تنبيغ استجابة لإشارة bioluminescent Y. مثقف طاعون داخل الخلايا 20 دقيقة بعد إضافة فج. وبالعاثية مراسل هي أيضا قادرة على الكشف عن مباشرة Y. طاعون في مصفوفات السريرية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث الأعمال الصغيرة الابتكار من المعاهد الوطنية للصحة (NIAID ، 1R43AI082698 – 01) وزارة الزراعة معهد الوطني للأغذية والزراعة (NIFA ، 2009-33610-20028).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Difco LB agar, Miller | VWR | 90003-346 |
| Difco LB broth, Miller | VWR | 90003-350 |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific | 1485-0810 |
| n-Decanal | Sigma | D7384 |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. . Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , (2000).
- . . , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. . CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
