Summary

Un système de dosage Free Cell Estimation de la capacité de neutralisation de GM-CSF recombinant soluble à l'aide d'anticorps GM-CSF récepteur

Published: June 27, 2011
doi:

Summary

Nous avons conçu un dosage des récepteurs cellulaires sans liant en vue d'estimer la liaison de granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) pour les récepteurs. Il nous permet d'évaluer l'inhibition compétitive de biotinylé GM-CSF se liant à des récepteurs solubles de GM-CSF alpha par le GM-CSF d'auto-anticorps avec une excellente reproductibilité.

Abstract

Arrière-plans: Auparavant, nous avons démontré que la capacité de neutraliser, mais pas la concentration de GM-CSF d'auto-anticorps a été corrélée avec la sévérité de la maladie chez les patients atteints protéinose alvéolaire auto-immune pulmonaire (PAP) 1-3. Comme l'abrogation de GM-CSF bioactivité dans le poumon est la cause probable pour PAP auto-immunes 4,5, il est prometteur de mesurer la capacité de neutralisation des anticorps GM-CSF pour évaluer la sévérité de la maladie chez chaque patient avec PAP.

Jusqu'à présent, la capacité de neutralisation de GM-CSF auto-anticorps a été évaluée en évaluant l'inhibition de la croissance de cellules humaines de la moelle osseuse ou cellules TF-1 stimulées par le GM-CSF 6-8. Dans le système de dosage biologique, cependant, il est souvent problématique pour obtenir des données fiables ainsi que de comparer les données de différents laboratoires, en raison des difficultés techniques dans le maintien des cellules dans un état constant.

OBJECTIF: Pour imiter le GM-CSF se liant à des récepteurs du GM-CSF à la surface cellulaire utilisant des cellules sans liaison au récepteur-dosage.

Méthodes: soie transgénique technologie a été appliquée pour obtenir une grande quantité d'alpha recombinant soluble du récepteur GM-CSF (sGMRα) avec une grande pureté 9-13. Le sGMRα recombinante a été contenue dans les couches séricine hydrophile de fils de soie sans être fusionnée à la protéine de soie, et donc, nous pouvons facilement extraire à partir des cocons de bonne pureté avec des solutions aqueuses neutres 14,15. Heureusement, les structures d'oligosaccharides, qui sont critiques pour la liaison avec le GM-CSF, sont plus semblables à des structures de sGMRα humaines que celles produites par d'autres insectes ou les levures.

RÉSULTATS: Le système de dosage sans cellule en utilisant sGMRα donné les données avec une grande plasticité et leur fiabilité. Contraignant pour sGMRα GM-CSF était dose-dépendante inhibée par le GM-CSF polyclonaux auto-anticorps dans une manière similaire à l'essai biologique utilisant cellules TF-1, indiquant que notre nouveau système de dosage sans cellule en utilisant sGMRα est plus utile pour la mesure de l'activité neutralisante de GM-CSF auto-anticorps que le système d'essai biologique utilisant des cellules TF-1 ou de cellules osseuses humaines.

CONCLUSIONS: Nous avons établi un test sans cellule de quantifier la capacité de neutralisation de GM-CSF autoanticorps.

Protocol

1. Production et purification de sGMRα Amplifier l'ADNc d'sGMRα du placenta banque d'ADNc humain en chaîne par polymérase (PCR). Ajouter de base 50 5'-UTR séquence de fin de polyhédrine de baculovirus et 27 RGS bases codant His-tag à l'extrémité 3 'de l'amplicon PCR PCR par un autre. Insérez le produit amplifié par PCR dans un plasmide pMSG1.1MG. Injecter l'psGMR/M1.1MG construire avec le vecteur d'aide pHA3PIG dans des œufs de vers…

Discussion

Le test sans cellule estimé la capacité de neutralisation de GM-CSF auto-anticorps avec une excellente reproductibilité et de rapidité. L'inhibition de la fixation par le GM-CSF autoanticorps ou le sérum du patient fractions d'IgG a été évaluée par ce test. Les données ont montré une corrélation entre l'inhibition de la fixation de l'essai sans cellules et l'inhibition de croissance d'un test biologique utilisant cellules TF-1, respectivement. Le bio-essai a été largement utilisé, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes très reconnaissants à K. Nakagaki, le Dr H. Ishii, le Dr K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa pour leur précieuse contribution.

Materials

Name of reagent Company Catalog # Comments
human placenta cDNA library Takara
Nickel affinity column GE Healthcare 17-5247-01
biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) PIERCE 21339
rhGM-CSF (leukine) Genzyme Corporation
Nunc Immobilizer Amino Nalge Nunc International 436007
Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse Sigma-Aldrich H1029 0.2ml
blocking solution (StabilCoat) Surmodics SC01-1000 1000ml
ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate Invitrogen 43-8322
CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II Applied Biosystems T2214
chemiluminescence plate reader BERTHOLD TECHNOLOGIES TriStar LB 941

References

  1. Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
  2. Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
  3. Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
  4. Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
  5. Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
  6. Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
  7. Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
  8. Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
  9. Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
  10. Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5′-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
  11. Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
  12. Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  13. Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
  14. Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
  15. Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
  16. Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
  17. Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
  18. Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
  19. Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
  20. Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
  21. Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).

Play Video

Cite This Article
Urano, S., Tazawa, R., Nei, T., Motoi, N., Watanabe, M., Igarashi, T., Tomita, M., Nakata, K. A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor. J. Vis. Exp. (52), e2742, doi:10.3791/2742 (2011).

View Video