Un sistema de células de ensayo gratis Estimación de la capacidad de neutralización de GM-CSF recombinante soluble de anticuerpos con GM-CSF receptor
Summary
Se diseñó un ensayo de receptor de la célula-unión libre con el fin de estimar la unión de granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF) a los receptores. Que nos permite evaluar la inhibición competitiva de biotina GM-CSF unión a los receptores alfa soluble GM-CSF por GM-CSF autoanticuerpos con una excelente reproducibilidad.
Abstract
ANTECEDENTES: Anteriormente, hemos demostrado que la capacidad de neutralizar, pero no la concentración de GM-CSF autoanticuerpos se correlaciona con la severidad de la enfermedad en pacientes con proteinosis alveolar pulmonar autoinmune (PAP) 1-3. Como la derogación de GM-CSF en la bioactividad de pulmón es la causa probable de PAP 4,5 autoinmune, es prometedor para medir la capacidad de neutralización de anticuerpos GM-CSF para evaluar la gravedad de la enfermedad en cada paciente con PAP.
Hasta ahora, la capacidad de neutralización de anticuerpos GM-CSF ha sido evaluado mediante la evaluación de la inhibición del crecimiento de las células de la médula ósea o la TF-1 las células estimuladas con GM-CSF 6-8. En el sistema de bioensayo, sin embargo, es a menudo problemático obtener datos fiables, así como para comparar los datos de diferentes laboratorios, debido a las dificultades técnicas en el mantenimiento de las células en un estado constante.
OBJETIVO: Para imitar GM-CSF unión a receptores de GM-CSF en la superficie celular utilizando células libres de unión al receptor-ensayo.
Métodos transgénicos gusano de seda se ha aplicado la tecnología para la obtención de una gran cantidad de soluble recombinante alfa del receptor de GM-CSF (sGMRα) de alta pureza 13.09. El sGMRα recombinante estaba contenido en las capas sericina hidrofílico de hilos de seda sin ser fusionadas a las proteínas de la seda, y por lo tanto, es fácil extraer de los capullos de buena pureza con soluciones acuosas neutras 14,15. Afortunadamente, las estructuras de oligosacáridos, que son críticos para la unión con GM-CSF, son más similares a las estructuras de sGMRα humanos que las producidas por otros insectos o levaduras.
Resultados: El sistema de ensayo libre de células con sGMRα dado los datos con alta plasticidad y la fiabilidad. Unión a sGMRα GM-CSF fue dosis-dependiente inhibido por policlonal GM-CSF autoanticuerpos en una forma similar a los bioensayos con la TF-1 en las células, lo que indica que nuestra libre de células nuevo sistema de ensayo utilizando sGMRα es más útil para la medición de la actividad neutralizante de GM-CSF autoanticuerpos que el sistema de bioensayo con TF-1 de células o células humanas de médula ósea.
Conclusiones: Se estableció un ensayo libre de células cuantificar la capacidad de neutralización de GM-CSF autoanticuerpos.
Protocol
Discussion
El ensayo libre de células calcula la capacidad de neutralización de GM-CSF autoanticuerpos con una excelente reproducibilidad y rapidez. La inhibición de la unión de GM-CSF o fracciones de autoanticuerpos en suero de los pacientes IgG se evaluó en este ensayo. Los datos mostraron una correlación entre la inhibición de la unión de la prueba libre de células y la inhibición del crecimiento de un bioensayo con células TF-1, respectivamente. El bioensayo ha sido ampliamente utilizado, pero albergaba las dificult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a K. Nakagaki, el Dr. H. Ishii, el Dr. K. Suzuki, Yamagata A., Oofusa K. por su valiosa contribución.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5′-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
