Een celvrij Assay System Het inschatten van de neutraliserende vermogen van GM-CSF antilichaam met behulp van recombinante oplosbare GM-CSF receptor
Summary
We ontwierpen een cel-vrije receptor binding assay om de binding van granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) te schatten aan de receptoren. Het stelt ons in staat te evalueren competitieve remming van gebiotinyleerd GM-CSF binding aan oplosbare GM-CSF receptor alfa door GM-CSF autoantilichaam met uitstekende reproduceerbaarheid.
Abstract
ACHTERGRONDEN: Eerder hebben we aangetoond dat het neutraliseren van capaciteit, maar niet de concentratie van GM-CSF autoantilichaam was gecorreleerd met de ernst van de ziekte bij patiënten met auto pulmonale alveolaire proteïnose (PAP) 1-3. Als intrekking van GM-CSF bioactiviteit in de longen is de waarschijnlijke oorzaak voor auto-PAP 4,5, is het belooft de neutraliserende capaciteit van GM-CSF autoantilichamen maat voor het evalueren van de ernst van de ziekte in elke patiënt met PAP.
Tot nu toe is het neutraliseren van de capaciteit van GM-CSF autoantilichamen is beoordeeld door het evalueren van de groeiremming van menselijke beenmergcellen of TF-1 cellen gestimuleerd met GM-CSF 6-8. In de bioassay-systeem, is het echter vaak problematisch om betrouwbare gegevens en de gegevens te vergelijken van verschillende laboratoria, als gevolg van de technische problemen bij het handhaven van de cellen in een constante toestand.
DOELSTELLING: Het GM-CSF na te bootsen binding aan GM-CSF-receptor op het celoppervlak behulp van cel-vrije receptor-bindende-assay.
METHODEN: Transgene zijderups techniek was toegepast voor het verkrijgen van een groot bedrag voor recombinant oplosbaar GM-CSF receptor alpha (sGMRα) met een hoge zuiverheid 9-13. Het recombinante sGMRα werd opgenomen in de hydrofiele sericine lagen van de zijden draden zonder gefuseerd aan de zijde proteïnen, en dus kunnen we gemakkelijk van de cocons in goede zuiverheid extract met een neutrale waterige oplossingen 14,15. Gelukkig is de oligosaccharide structuren, die kritisch zijn voor de binding met GM-CSF, zijn meer vergelijkbaar met de structuur van de menselijke sGMRα dan die welke door andere insecten of gisten.
Resultaten: De cel-vrije assay systeem met behulp van sGMRα leverde de gegevens met hoge plasticiteit en betrouwbaarheid. GM-CSF binding aan sGMRα was dosis-afhankelijk geremd door polyklonaal GM-CSF autoantilichaam op een vergelijkbare manier aan de bioassay met behulp van TF-1-cellen, wat aangeeft dat onze nieuwe cel-vrije assay systeem met behulp van sGMRα is nuttiger voor het meten van neutraliserende activiteit van GM-CSF autoantilichamen dan de biologische systeem met behulp van TF-1 cel of een menselijke beenmergcellen.
Conclusies: We hebben een celvrije assay het kwantificeren van de neutraliserende capaciteit van GM-CSF autoantilichaam.
Protocol
Discussion
De cel-vrije assay schatting gemaakt van de neutraliserende capaciteit van GM-CSF auto-antilichamen met een uitstekende reproduceerbaarheid en snelheid. De bindende remming door GM-CSF autoantilichamen of de patiënt serum IgG fracties werd geëvalueerd door deze test. Uit de gegevens bleek een correlatie tussen de binding inhibitie van de cel-vrije test en de groeiremming van een bioassay met behulp van TF-1 cellen, respectievelijk. De bioassay is op grote schaal gebruikt, maar koesterde moeilijkheden bij het vergelijk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn erg dankbaar K. Nakagaki, dr. H. Ishii, dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa voor hun waardevolle bijdragen.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5′-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
