脑浸润白细胞的分离
Summary
一个快速的方法来获得从小鼠脑组织浸润的白细胞描述。这种方法利用了连续Percoll梯度和不连续的聚蔗糖梯度选择和净化白细胞富集层。然后可能会被隔离白细胞流式细胞仪测量的特点。
Abstract
我们描述了一个准备从老鼠的大脑浸润白细胞（BILs）的方法。我们演示了如何Theiler鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）通过一个快速的颅内注射技术和如何净化的全脑细胞浸润的白细胞富集人口感染小鼠。简单地说，小鼠是在一个封闭的腔异氟醚麻醉徒手与汉密尔顿注射器注入额叶皮层。然后被杀害后，小鼠感染的异氟醚过量和整个大脑中提取的RPMI匀浆与Tenbroeck组织磨床，在不同的时间。通过连续的30％Percoll梯度离心脑组织匀浆，以去除髓鞘和其他细胞碎片。细胞悬液，然后是紧张在40微米，洗净后，一个不连续的聚蔗糖 – 帕确加梯度离心选择和净化的白细胞。的白细胞，然后洗净，并在适当的缓冲区，通过流式细胞仪检测免疫重悬于。流式细胞仪检测显示人口先天免疫细胞的C57BL / 6小鼠在感染的早期阶段。多个亚群的免疫细胞在感染后24小时，目前，在BILs GR1 +，CD11b的+和F4/80 +细胞的丰富人口。因此，这种方法是有用的表征在大脑中的急性感染的免疫反应。
Protocol
1。颅内病毒注射液： 下面的技术已被修改，并广泛利用我们的实验室和他的同事。简单地说，丹尼尔的应变Theiler鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）或假感染颅内注射（1，10）是年轻小鼠（最好5-6周龄）引起脑浸润白细胞（BILs）。请注意，结果会有所不同，丹尼尔的应变，豆株，GDVII应变之间。对于采伐BILs的目的，小鼠收到2X10 TMEV 5 PFU和感染24小时。 将注射针头（27压?…
Discussion
我们经常使用流式细胞仪检测，以确定两者的大脑浸润细胞制备的质量，并区分不同人群的免疫细胞2，9 。急性发作的时间点，我们BILs方法产生炎症单核细胞内CD45hi人口以及CD45lo人口中的巨噬细胞的高百分比的高比例。这表明，在大脑中重现的免疫反应，我们的方法可以有力特点。
这种技术是特别重要的实验，需要一个良好的特点，从小鼠大脑中的免疫细胞的人口?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NS64571由赠款支持这项工作是从NINDS（CLH），由早期的职业生涯从梅奥诊所（CLH）发展奖，由唐纳德和弗朗西斯Herdrich（CLH）的厚礼。我们想感谢帮助梅奥诊所的流式细胞仪核心。
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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Tags
Brain-infiltrating LeukocytesBILsMiceTheiler’s Murine Encephalomyelitis VirusTMEVIntracranial Injection TechniqueLeukocyte PurificationBrain HomogenizationPercoll GradientCell SuspensionFicoll-Paque Plus GradientImmunophenotypingFlow CytometryInnate Immune CellsGr1+CD11b+F4/80+ CellsImmune ResponseAcute Infection
Cite This Article
LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747, doi:10.3791/2747 (2011).