두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에
Summary
마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서 프로토콜<em> 생체내에</em두 광자 현미경을 사용하여> 척수 이미징이 설명되어 있습니다. 이 방법은 호흡 유발 움직임을 최소화하고 더 정렬 또는 후처리 다른 필요하지 원시 영상 자료를 생산하기 위해 척추 안정화 장치와 마취 처방을 결합한 제품입니다.
Abstract
유전자 특정 세포 타입 2-3가 크게 생체내 4-7의 수많은 조직의 생리와 병리 학적 과정을 우리의 지식을 넓혀이에 형광 단백질을 표현할 수 있도록 설계되었습니다 생쥐 두 – 광자 현미경 하나를 사용하여 생체내 이미징에. 중추 신경계 (CNS)의 연구에서는 소설의 과다 등에 따라 뉴런, astrocytes, microglia로 세포의 행동에 대해 종종 예상치 못한 결과를 생산했다 두뇌의 생체내 이미징의 광범위한 응용 프로그램을 찾고있다 생리적 또는 병적인 상태 8-17. 그러나, 대부분 기술적인 합병증은 살아있는 마우스 척수 연구에서 생체내 이미징의의 구현을 제한합니다. 특히, 폐, 심장에 척수의 해부 가까이 이미징 살아있는 척수 도전 과제 만들어 상당한 운동 유물을 생성합니다. </P>
우리는 척추를 안정화 호흡 유도 동작을 감소시키고 생체내에서 이미지를 마우스 척수를 두 광자 현미경의 사용을 촉진하여 척수 이미징의 고유의 한계를 극복 소설 방법을 개발했습니다. 이것은 호흡 유도 동작을 크게 감소 그 결과, 깊은 마취의 방법으로 사용자 정의 척추 안정화 장치를 결합하여 이루어진다. 이 비디오 프로토콜은 조직 부상을 유지하고 최소한으로 출혈하여 장시간 동안 안정적인 생리 조건 하에서 유지 수있는 살아있는 척수의 작은 영역을 노출하는 방법을 보여줍니다. 대표 원시 이미지는 고해상도의 생체내 자세히 microglia와 vasculature 사이의 밀접한 관계를 인수했다. timelapse 시퀀스가 살아있는 마우스 척수에있는 microglial 프로세스의 역동적인 동작을 보여줍니다. 또한, 같은 Z – 프레임의 연속 스캔이 입증이 방법은 이미지 정렬 후 획득을 필요로하지 않는 이미지 및 / 또는 timelapse 영화 스택을 생성 달성할 수있는 뛰어난 안정성의. 마지막으로, 우리는 생체내에 지속적인 생리적 또는 병적인 프로세스 종단 연구 있으므로이 방법은 나중에 timepoints에서 척수의 동일한 영역을 다시 방문하고 reimage하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Discussion
방법은 여기서 설명하는 것은 허용에 대한 안정적이고 두 광자 현미경을 사용하여 anesthetized 생쥐의 척수에서 인구 밀도가 높은 형광 세포 구조의 생체내 이미징의 반복. 달성 안정성은 맞춤 제작 척추 안정화 장치와 호흡 유발 운동 유물을 감소 마취 처방의 결과입니다. 척추 안정화 장치는 마우스 본체 아래 호흡 공간을 허용하고 상용 척추 클램프 및 헤드 장착 부분 (그림 1)를 사용하여 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 다중 경화증에 의해 지원되었다 부여 사회 적응 및 / 또는 Davalos 외., J Neurosci 방법에서 reprinted KA 피규어와 영화 DD와 NIH / NINDS 보조금 NS051470, NS052189 및 NS066361에 RG4595A1 / T. 2008 3월 30일, Elsevier의 허가를 169 (1) :1 – 7 2,008 저작권.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd Labs | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment |
Phoenix pharmaceutical |
NDC No: 57319-760- 25 |
Lubricant |
| Betadine | Fisher | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors |
World Precision Instruments |
555500S | Curved, blunt-tip scissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments |
555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia,Pfizer Inc. | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps |
Narishige | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences Corp. |
80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. |
NDC No: 12496- 6757-1 |
Buprenorphine, injectable |
| Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad – Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer’s disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer’s disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
