Preimplantation भ्रूण hypertonic cryoprotective समाधान में नियुक्ति के बाद cryopreserved सेलुलर निर्जलीकरण के कारण हो सकता है. संतुलन के बाद, बर्फ क्रिस्टल गठन के भ्रूण के आसपास के समाधान में प्रेरित है. इसके अलावा निर्जलीकरण होता है के रूप में भ्रूण धीरे भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में डूबनेवाला से पहले subzero तापमान ठंडा करने के लिए.
पशु, भेड़ और बकरियों से Preimplantation भ्रूण कम या लंबी अवधि के भंडारण के लिए cryopreserved हो सकता है. Preimplantation भ्रूण पानी की मुख्य रूप से मिलकर बनता है, और cryopreservation प्रक्रिया के दौरान intracellular बर्फ क्रिस्टल के गठन के परिहार भ्रूण व्यवहार्यता बनाए रखने के महत्व सर्वोपरि है. Ethylene glycol (जैसे) या (GLYC) ग्लिसरॉल कि सेलुलर निर्जलीकरण की सुविधा के लिए एक आसमाटिक ढाल बनाने जैसे cryoprotective एजेंट (सीपीए) के भ्रूण को एक hypertonic समाधान (1.5 एम 1.4) में रखा जाता है. बाद भ्रूण CPA समाधान में आसमाटिक संतुलन तक पहुँचने, वे व्यक्तिगत रूप से ठंड के लिए 0.25 मिलीलीटर प्लास्टिक तिनके में hypertonic CPA समाधान में लोड कर रहे हैं. भ्रूण -6 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर एक नियंत्रित दर फ्रीजर में रखा जाता है बर्फ के क्रिस्टल गठन सीपीए भ्रूण आसपास के समाधान में प्रेरित है, और crystallization भ्रूण के बाहर सीपीए की एकाग्रता में वृद्धि का कारण बनता है, आगे सेलुलर निर्जलीकरण के कारण है. भ्रूण 0.5 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर पर ठंडा कर रहे हैं, आगे निर्जलीकरण को सक्षम करने, तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) में डूब जा रहा है पहले -34 ° सी के एक तापमान करने के लिए. Cryopreserved भ्रूण से पहले thawed प्राप्तकर्ता (सरोगेट) महिला को हस्तांतरण किया जाना चाहिए. तिनके भ्रूण युक्त तरल नाइट्रोजन Dewar, 3 से 5 सेकंड के लिए कमरे तापमान हवा में आयोजित किया है, से हटा रहे हैं और 25 से 30 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा जाता है. भ्रूण GLYC में cryopreserved 1 sucrose के एक सीपीए के प्राप्तकर्ता (सरोगेट) महिला के लिए हस्तांतरण से पहले हटाने के लिए 10 मिनट के लिए एम के समाधान में रखा है. भ्रूण ईजी में cryopreserved, तथापि, सीधे एक प्राप्तकर्ता के गर्भाशय में स्थानांतरित किया जा सकता है.
क्योंकि भ्रूण पानी की मुख्य रूप से मिलकर बनता है, यह महत्वपूर्ण है कि preimplantation भ्रूण को पर्याप्त रूप से निर्जलित है और धीरे धीरे प्रोटोकॉल के साथ अनुसार ठंडा हो ल intracellular बर्फ क्रिस्टल के गठन से बचने के है. एक बार ठंडा करने की प्रक्रिया शुरू हो गई है, यह महत्वपूर्ण है यूनिडायरेक्शनल तापमान परिवर्तन को बनाए रखने और तापमान के उतार चढ़ाव से बचने के. बर्फ क्रिस्टल गठन विशिष्ट CPA समाधान के लिए एक उचित तापमान पर ("बोने") की शुरूआत महत्वपूर्ण है.
इस धीमी गति / ठंडा preimplantation भ्रूण cryopreservation के लिए तेजी से विगलन विधि करने के लिए संशोधन के एक कदम विधि (जहां भूसे में लोड मध्यम के अंतिम स्तंभ के बजाय सीपीए समाधान sucrose) 19 और प्रत्यक्ष हस्तांतरण विधि (जहां भ्रूण ethylene glycol में जमे हुए शामिल thawed रहे हैं और पहले) भ्रूण 20 से ethylene glycol को हटाने के बिना एक प्राप्तकर्ता महिला के गर्भाशय को सीधे हस्तांतरित. एक सीधा हस्तांतरण (डीटी) प्राप्तकर्ता महिला के गर्भाशय में ethylene glycol की मात्रा को कम करने के लिए जमा, 6 सेमी से पहले जारी रखने के रूप में पहले वर्णित मध्यम जोत के साथ 0.25 मिलीलीटर पुआल भरने की सलाह दी जाती है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक स्वैच्छिक मानक वाणिज्यिक भ्रूण स्थानांतरण उद्योग है कि preimplantation डीटी के लिए cryopreserved भ्रूण पीले रंग तिनके में जमे हुए किया जाना चाहिए और तरल नाइट्रोजन Dewar में पीले रंग goblets में संग्रहीत के भीतर मौजूद चाहिए. वाणिज्यिक उद्योग भी सभी cryopreserved भ्रूण कि पालन किया जाना चाहिए के लिए विशिष्ट लेबलिंग आवश्यकताओं है.
इस विधि के लिए वैकल्पिक कांच में रूपांतर 21, गैर संतुलन cryopreservation जहां एक और अधिक अत्यधिक ध्यान केंद्रित CPA (6-8 एम) समाधान अल्ट्रा तेजी से सीपीए समाधान तरल से बर्फ के बिना एक "बेजान" राज्य बदलने के लिए पैदा करने के लिए ठंडा है की एक विधि है गठन क्रिस्टल. कांच में रूपांतर भ्रूण कि कम developmentally कॉम्पैक्ट morula उनके बढ़ा तापमान संवेदनशीलता के कारण की तुलना में उन्नत कर रहे हैं cryopreservation के लिए बेहतर संभावना अनुकूल है.
इस तकनीक को अंतरराष्ट्रीय वाणिज्यिक भ्रूण स्थानांतरण उद्योग के लिए अद्वितीय जर्मप्लाज्म 22 संसाधनों के संरक्षण के लिए आवेदन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से है, जहां लगभग 500,000 गोजातीय preimplantation कैलेंडर वर्ष 2008 में हस्तांतरित भ्रूण के 55% से अधिक cryopreserved थे 23.
The authors have nothing to disclose.
USDA अनुसंधान बहु राज्य परियोजना से आंशिक धन डब्ल्यू 2171 "रोगाणु सेल और भ्रूण के विकास पशुधन में सुधार के लिए और हेरफेर" आभार स्वीकार किया है. रयान Callahan, जो इस लेख का वीडियो भाग के लिए तकनीकी चित्र तैयार की कलात्मक प्रतिभा को भी आभार स्वीकार कर रहे हैं.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
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BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
ViGro thaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
SYNGRO Holding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco’s phosphate buffered saline |
BioLife BSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
BioLife antibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
BioLife trypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
Name of the equipment | Company | Catalog number | Comments (optional) |
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Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |