Preimplantatorisk embryon får frysförvarade efter placering i en hyperton cryoprotective lösning för att orsaka cellulär uttorkning. När jämvikt är is kristaller bildas induceras i den lösning som omger embryot. Ytterligare uttorkning inträffar som embryot är långsamt kyls till minusgrader innan kastar sig in i flytande kväve för förvaring.
Preimplantatorisk embryon från nötkreatur, får och getter kan frysförvarade för kort-eller långsiktig lagring. Preimplantatorisk embryon består huvudsakligen av vatten, och undvikande av intracellulära is kristaller bildas under frysförvaring processen är av största vikt att upprätthålla embryo bärkraft. Embryon placeras i en hyperton lösning (1,4 – 1,5 m) i en cryoprotective agent (CPA) som etylenglykol (EG) eller glycerol (GLYC) för att skapa ett osmotiskt lutning som underlättar cellulär uttorkning. Efter embryon nå osmotiska jämvikten i CPA lösningen, de är individuellt laddas i hyperton CPA lösningen till 0,25 ml plast strån för infrysning. Embryon placeras i en kontrollerad takt frys vid en temperatur på -6 ° C. Ice kristallbildning induceras i CPA lösningen kring embryot och kristallisering orsakar en ökning av koncentrationen av CPA utanför embryot, vilket orsakar ytterligare cellulär uttorkning. Embryon kyls med en hastighet på 0,5 ° C / min, vilket möjliggör ytterligare uttorkning, till en temperatur på -34 ° C innan det störtade ner i flytande kväve (-196 ° C). Frysförvarade embryon måste tinas innan de överförs till en mottagare (surrogat) kvinnor. Strån innehåller embryona bort från flytande kväve Dewar, som hölls i rumstemperatur luften i 3 till 5 sek, och placeras i en 37 ° C vattenbad under 25 till 30 sek. Embryon frysförvarade i GLYC placeras i en 1 M lösning av sackaros i 10 min för borttagning av CPA innan de överförs till en mottagare (surrogat) kvinnor. Embryon frysförvarade i t.ex. dock kan direkt överföras till livmodern på en mottagare.
Eftersom embryon består huvudsakligen av vatten, är det viktigt att preimplantatorisk embryon vara tillräckligt uttorkad och långsamt kylas i enlighet med det protokoll som beskrivs här för att undvika intracellulära bildas is kristall. När nedkylningen har påbörjats, är det viktigt att upprätthålla enkelriktad temperaturförändringar och för att undvika temperaturväxlingar. Inledande av is kristaller bildas ("seeding") vid en lämplig temperatur för det specifika CPA lösningen är kritisk.
Ändringar i långsam kylning / snabb upptining metoden för preimplantatorisk embryo frysförvaring inkludera en-steg-metoden (där den sista kolumnen av medium laddas i halmen är sackaros istället för CPA-lösning) 19 och direkt överföring metoden (där embryona fryses i etylenglykol tinas upp och överförs direkt till livmodern av en mottagare kvinnlig utan att först ta bort etylenglykol från embryot) 20. För att minska volymen av etylenglykol sätts in i livmodern på en direkt överföring (DT) mottagaren kvinnliga, är det lämpligt att fylla 0,25 ml halmen med 6 cm hålla mediet innan du fortsätter enligt tidigare beskrivning. Det bör noteras att en frivillig standard finns inom den kommersiella embryoåterföring industri som preimplantatorisk embryon frysförvarade för DT bör frysas i gult färgade sugrör och lagras i gulfärgade pokaler i flytande kväve Dewar. Den kommersiella industrin har också särskilda krav på märkning av alla frysförvarade embryon som bör följas.
Ett alternativ till denna metod är förglasning 21, en ojämviktsmetod för frysförvaring där en mer koncentrerad (6-8 M) CPA Lösningen kyls extremt snabbt orsakar CPA lösning för att ändra från flytande till en "glasigt" tillstånd utan is kristaller bildas. Förglasning är sannolikt bättre lämpade för frysförvaring av embryon som är mindre utvecklingsmässigt avancerade än kompakt morula på grund av deras ökade temperaturkänslighet.
Denna teknik har ansökan om bevarande av unika arvsmassa resurser 22, liksom den internationella kommersiella embryoåterföring bransch där mer än 55% av de ungefär 500 tusen nötkreatur preimplantatorisk embryon under kalenderåret 2008 var frysförvarade. 23
The authors have nothing to disclose.
Delfinansiering från USDA flera stater forskningsprojektet W-2171 "könsceller och embryon utveckling och manipulation för förbättring av boskap" är tacksamt erkänns. Den konstnärliga talanger Ryan Callahan, som utarbetat tekniska illustrationer för videodelen av denna artikel, är också tacksamt erkänns.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
ViGro thaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
SYNGRO Holding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco’s phosphate buffered saline |
BioLife BSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
BioLife antibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
BioLife trypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
Name of the equipment | Company | Catalog number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |