بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا
Summary
نحن حاضرنا الأمثل بروتوكول nucleofection عالية الإنتاجية باعتبارها وسيلة فعالة لtransfecting الوحيدات الإنسان الأساسية المستمدة من الخلايا الجذعية إما مع DNA البلازميد أو سيرنا دون التسبب في نضوج الخلايا. ونحن نقدم أدلة أخرى لإسكات سيرنا الناجح لاستهداف الجينات RIG – I مرنا في كل المستويات والبروتين.
Abstract
ويمكن اعتبار الخلايا الجذعية (DCS) حراسا للنظام المناعي والتي تلعب دورا حاسما في بدء وردا على العدوى 1. الكشف عن مستضد الممرضة التي السذاجة البلدان النامية من خلال التعرف على الأنماط مستقبلات (PRRs) والتي هي قادرة على الاعتراف هياكل محددة الحفظ ويشار إلى الممرض المرتبطة بأنماط الجزيئي (PAMPS). كشف من قبل البلدان النامية PAMPs مشغلات تسقط إشارات بين الخلايا مما يؤدي إلى تنشيط والتحول إلى البلدان النامية ناضجة. وتتميز عادة هذه العملية من خلال انتاج الانترفيرون من النوع 1 جنبا إلى جنب مع السيتوكينات proinflammatory أخرى ، upregulation من علامات سطح الخلية مثل MHCII وCD86 والهجرة في العاصمة ناضجة لتصريف الغدد الليمفاوية ، حيث التفاعل مع الخلايا التائية يبدأ الاستجابة المناعية التكيفية 2 ، 3. وبالتالي ، DCS ربط أنظمة المناعة الفطرية والتكيفية.
القدرة على تشريح الشبكات الجزيئية الكامنة وراء العاصمة ردا على مسببات الأمراض المختلفة ضروري لفهم أفضل لتنظيم هذه المسارات إشارة وجيناتها المستحث. وينبغي أن يساعد أيضا تسهيل تطوير العاصمة مقرا لقاحات ضد الأمراض المعدية والأورام. ومع ذلك ، فقد كان هذا الخط من البحوث أعاق بشدة من جراء صعوبة transfecting البلدان النامية الأولية 4.
وعادة ما تستخدم أساليب تنبيغ الفيروس ، مثل نظام lentiviral ، ولكنها تحمل الكثير من القيود مثل التعقيد والمخاطر البيولوجية الخطرة (مع التكاليف المرتبطة بها) 5،6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، وتسليم المنتجات الجين الفيروسي يزيد من استمناع تلك transduced 9،10،11،12 البلدان النامية. وقد استخدمت Electroporation مع نتائج مختلطة 13،14،15 ، ولكن نحن أول من التقرير استخدام بروتوكول ترنسفكأيشن الإنتاجية العالية ، وتثبت بشكل قاطع فائدتها.
نحن في هذا التقرير تلخيص وضع بروتوكول تجاري لتحسين الإنتاجية العالية من البلدان النامية ترنسفكأيشن الأولية الإنسان ، مع سمية الخلية محدودة وعدم وجود نضوج العاصمة 16. وكانت الكفاءة ترنسفكأيشن (من البلازميد GFP) وبقاء الخلية أكثر من 50 ٪ و 70 ٪ على التوالي. أنشئت FACS تحليل غياب زيادة في التعبير عن علامات النضج وCD86 MHCII transfected في الخلايا ، في حين تظاهر qRT – PCR لا upregulation من IFNβ. باستخدام هذا البروتوكول electroporation ، ونحن نقدم الدليل على نجاح ترنسفكأيشن البلدان النامية مع سيرنا وفعالة نهدم من الجينات المستهدفة RIG – I ، مفتاح مستقبلات الاعتراف الفيروسي 16،17 في مرنا على حد سواء ، ومستويات البروتين.
Protocol
Discussion
ترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية الأولية السذاجة المهم لتحليل إنتاجية عالية والهندسة العكسية من التهابات المسالك الخليوي في هذه الخلية الرئيسية تتوسط الانتقال فطرية – التكيف المناعي. ومع ذلك ، فإن معظم المحققين وجدت أن هذه الخلايا من الصعب على حد سواء transfect بكفاءة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة العقد رقم HHSN2662000500021C المعدية. نشكر تشن مينغ لمساعدته التقنية.
Materials
| Equipment/Reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, . Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, . Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. a. n. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , .
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
