Summary

Protocole optimisé pour une transfection efficace des cellules dendritiques, sans maturation cellulaire

Published: July 08, 2011
doi:

Summary

Nous présentons notre protocole optimisé nucléofection à haut débit comme un moyen efficace de transfection humaines primaires dérivées de monocytes des cellules dendritiques avec soit l'ADN plasmidique ou siRNA sans causer la maturation des cellules. En outre, nous fournir des preuves pour faire taire les siARN réussie de gène ciblé RIG-I à la fois au niveau ARNm et des protéines.

Abstract

Cellules dendritiques (CD) peuvent être considérés comme des sentinelles du système immunitaire qui jouent un rôle critique dans son initiation et une réponse à l'infection. Détection de l'antigène pathogènes par les CD naïve est à travers des récepteurs de reconnaissance des motifs (PRR) qui sont capables de reconnaître des structures spécifiques conservé appelé pathogène motifs moléculaires associés (PAMPS). Détection des PAMPs par les CD déclenche une cascade de signalisation intracellulaire entraîne leur activation et de transformation pour les PED matures. Ce processus est généralement caractérisé par une production d'interféron de type 1 avec d'autres cytokines pro-inflammatoires, la régulation positive des marqueurs de surface cellulaire, comme CMHII et CD86 et la migration des DC matures dans les ganglions lymphatiques drainant, où l'interaction avec les cellules T initie la réponse immunitaire adaptative 2, 3. Ainsi, les PED relier les systèmes immunitaire innée et adaptative.

La capacité à disséquer les réseaux moléculaires qui sous-tendent la réponse à divers pathogènes DC est cruciale pour une meilleure compréhension de la régulation de ces voies de signalisation et de leurs gènes induits. Il devrait également aider à faciliter le développement de vaccins à base de DC contre les maladies infectieuses et les tumeurs. Cependant, cette ligne de recherche a été gravement entravée par la difficulté de transfecter des primaires PED 4.

Méthodes de transduction virus, tels que le système lentiviral, sont généralement utilisés, mais portent de nombreuses limitations telles que la complexité et de la bio-dangereux risque (avec les coûts associés) 5,6,7,8. En outre, la livraison de produits de gènes viraux augmente l'immunogénicité de ces transduites PED 9,10,11,12. L'électroporation a été utilisée avec des résultats mitigés 13,14,15, mais nous sommes les premiers à signaler l'utilisation d'un protocole de transfection à haut débit et de manière concluante démontrer son utilité.

Dans ce rapport, nous résumons un protocole optimisé commerciale pour la transfection à haut débit des humains PED primaire, avec une toxicité cellulaire limitée et une absence de maturation des DC 16. Efficacité de la transfection (de plasmide GFP) et la viabilité des cellules ont été plus de 50% et 70% respectivement. FACS analyse a établi l'absence d'augmentation de l'expression des marqueurs de la maturation du CD86 et CMH II dans des cellules transfectées, tandis qRT-PCR n'a démontré aucune régulation à la hausse des IFNβ. En utilisant ce protocole d'électroporation, nous fournir des preuves pour la transfection réussie des PED avec le siRNA et efficace abattre des gènes ciblés RIG-I, un récepteur de reconnaissance clés virale 16,17, à la fois l'ARNm et de protéine.

Protocol

1. Programme du 96 Amaxa ainsi Nucleofector navettes Ouvrez un nouveau fichier de paramètres. Sélectionnez le nombre de puits que vous allez utiliser pour la transfection standards en faisant glisser le curseur sur le diagramme de plaque de 96 puits. Utiliser un minimum de trois puits à la piscine pour chaque échantillon expérimental. Entrez le code du programme: en part1 sélectionnez 'FF' et choisissez part2 '168 'à partir des menus déroulants De la boît…

Discussion

Transfection efficace des cellules dendritiques naïves primaire est importante pour l'analyse à haut débit et l'ingénierie inverse des voies cellulaires inflammatoires dans cette cellule clé de la médiation de la transition innée-immune adaptative. Cependant, la plupart des chercheurs estiment que ces cellules sont difficiles à transfecter fois efficace et sans la maturation de transfection de cellules induisant la procédure lors de l'utilisation des techniques de transfection standard. Nous avons r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le projet a été soutenu par le NIH NIAID Marché n HHSN2662000500021C. Nous remercions Ming Chen pour son assistance technique.

Materials

Equipment/Reagent Company Catalogue # Comments
Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Lonza 108S0109 Serial number
Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit Lonza VHPA-2007 Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates
RIG-I siRNA Dharmacon L-012511-00  
GLO siRNA Dharmacon D-001600-01-20  
RPMI 1640 Invitrogen 11875 Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium
DMEM Invitrogen 11965  
L-glutamine Invitrogen 25030081  
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15070063  
Fetal Calf Serum HyClone 3070.03  
Dendritic Cells New York Blood center   DCs are purified from buffy coats using a standard procedure

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Cite This Article
Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation. J. Vis. Exp. (53), e2766, doi:10.3791/2766 (2011).

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