Een protocol voor het verzamelen en Kleuring Hemocytes uit de Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti</em
Summary
Een vereenvoudigde toch nauwkeurige methode voor het verzamelen en vlekken mug hemocytes wordt beschreven. Onze methode combineert de eenvoud van perfusie met de nauwkeurigheid van hoge injectie technieken om schoon voorbereidingen van hemocytes in Aedes muggen te isoleren. Deze methode maakt studies vereist kennis van de soorten hemocytes en hun overvloed.
Abstract
Muggen zijn vectoren voor een aantal ziekteverwekkende pathogenen, zoals de gele koorts virus, malaria parasieten en filaria wormen. Laboratoria onderzoeken anti-pathogeen componenten van het aangeboren immuunsysteem bij de ziekte van vectorsoorten in de hoop van het genereren van transgene muggen die ongevoelig zijn voor een dergelijke pathogenen 1, 2. Het aangeboren immuunsysteem van muggen bestaat uit verschillende lijnen van de verdediging 3. Pathogenen die erin slagen om de barrière opgelegd door de epitheel-omzoomde muggen middendarm 4 te ontsnappen gaan de hemolymfe en ontmoeting circulerende hemocytes, belangrijke cellulaire componenten die in te kapselen en verzwelgen pathogenen 5, 6. Onderzoekers hebben geen bewijs gevonden voor hematopoietische weefsels in de muggen en de huidige gegevens wijzen erop dat het aantal hemocytes is vastgesteld op volwassen opkomst en het aantal kan zelfs afnemen als de mug leeftijd 7. Het vermogen om goed te verzamelen en te identificeren hemocytes van medisch belangrijke insecten is een essentiële stap voor studies in de cellulaire immuniteit. Echter, de geringe omvang van muggen en de beperkte volume van hemolymfe vormen een uitdaging voor het verzamelen van immuuncellen.
Twee gevestigde methoden voor het verzamelen muggen hemocytes zijn uitzetting van hemolymfe van een snee slurf 8, en het volume verplaatsing (perfusie), waarin de zoutoplossing wordt in de vliezige necklike gebied geïnjecteerd tussen de kop en de thorax (dat wil zeggen, cervix) en de geperfuseerde hemolymfe wordt verzameld uit een gescheurde opening in een distale regio van de buik 9, 10. Deze technieken zijn echter beperkt door de lage herstel van de hemocytes en mogelijke vervuiling door vet lichaamscellen, respectievelijk 11. Meer recent een methode aangeduid als high injectie / herstel verbeterde terugvordering van de immunocytes door het gebruik van anticoagulantia buffers terwijl het verminderen van het niveau van verontreinigende schalen en de interne weefsels 11. Terwijl die methode zorgt voor een verbeterde methode voor het verzamelen en onderhouden van hemocytes voor de primaire cultuur, het betekent een aantal van de injectie en het verzamelen van stappen die niet nodig zijn als de stroomafwaartse doel is het verzamelen, repareren en vlek hemocytes voor de diagnostiek. Hier tonen we onze methode voor het verzamelen van muggen hemolymfe dat de eenvoud van perfusie gecombineerd, met behulp van anti-stollingsmiddel buffers in plaats van een zoutoplossing, met de nauwkeurigheid van de hoge injectie technieken om schoon voorbereidingen van hemocytes in Aedes muggen te isoleren.
Protocol
Discussion
De hemocyte collectie hier beschreven methode is aangepast van eerder gepubliceerde methoden en laat een schoon te maken bereidingen van hemocytes van Aedes muggen isoleren met minder stappen. Terwijl onze bijzondere interesse ligt in het karakteriseren van hemocyte populaties in Aedes muggen, geloven wij deze techniek kan worden toegepast op andere mug groepen na de eerste proeven worden uitgevoerd om de juiste injectie volumes te bepalen. Ons protocol maakt gebruik van anti-stollingsmiddel buffers in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs willen graag John Frey en Ben Peterson bedanken voor muggen opfok. We danken ook Christine Davis en Gary Radice voor hulp bij hemocyte microfoto. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Universiteit van Richmond Arts & Science zomer fellowship naar AA Qayum en de faculteit te verlenen aan A. Telang.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) |
Sutter Instrument | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
