Un protocolo para la recolección y la tinción de los hemocitos del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti</em
Summary
Un método simplificado pero preciso para recoger y mancha hemocitos mosquito se describe. Nuestro método combina la simplicidad de la perfusión con la precisión de las técnicas de inyección de alta para aislar a los preparativos limpia de hemocitos en los mosquitos Aedes. Este método facilita el conocimiento de los estudios que requieren los tipos de hemocitos y su abundancia.
Abstract
Los mosquitos son vectores de una serie de patógenos que causan enfermedades como el virus de la fiebre amarilla, parásitos de la malaria y filarias. Los laboratorios están investigando anti-patógeno componentes del sistema inmune innato en la especie vector de la enfermedad con la esperanza de la generación de mosquitos transgénicos que son refractarios a los agentes patógenos como 1, 2. El sistema inmune innato de los mosquitos se compone de varias líneas de defensa 3. Patógenos que logran escapar de la barrera impuesta por el mosquito del epitelio del intestino medio-alineado 4 entrar en la hemolinfa y el encuentro hemocitos circulantes, componentes celulares importantes que encapsulan y patógenos engullir 5, 6. Los investigadores no han encontrado pruebas de los tejidos hematopoyéticos en los mosquitos y la evidencia actual sugiere que el número de hemocitos se fija en la emergencia de adultos y los números en realidad puede disminuir a medida que el mosquito 7. La capacidad de recoger e identificar correctamente los hemocitos de los insectos de importancia médica es un paso esencial para los estudios en la inmunidad celular. Sin embargo, el pequeño tamaño de los mosquitos y el limitado volumen de hemolinfa plantean un desafío a la recogida de las células inmunitarias.
Dos métodos establecidos para la recolección de hemocitos mosquitos incluyen la expulsión de la hemolinfa de un corte trompa 8, y el desplazamiento de volumen (perfusión), en el que la solución salina es inyectada en la región necklike membranosa entre la cabeza y el tórax (es decir, el cuello uterino) y la hemolinfa perfundidos recogidos se a partir de una apertura de partido en una región distal del abdomen 9, 10. Estas técnicas, sin embargo, están limitadas por la baja recuperación de los hemocitos y la posible contaminación por las células de grasa corporal, respectivamente 11. Más recientemente, un método conocido como de inyección de alta / recuperación de la recuperación mejorada de inmunocitos por el uso de tampones anticoagulante, mientras que la reducción de los niveles de contaminación de las escalas y los tejidos internos 11. Mientras que el método permite un mejor método de recopilación y mantenimiento de hemocitos para cultivo primario, que conlleva una serie de medidas de inyección y recolección que no son necesarios si el objetivo posterior es recoger, fijar y teñir hemocitos para el diagnóstico. Aquí, demostramos nuestro método de recolección de la hemolinfa de mosquitos que combina la simplicidad de la perfusión, usando tampones anticoagulante en lugar de solución salina, con la precisión de las técnicas de inyección de alta para aislar a los preparativos limpia de hemocitos en los mosquitos Aedes.
Protocol
Discussion
El método de recogida de hemocitos se describe aquí es una modificación de los métodos publicados anteriormente y permite aislar los preparativos limpia de hemocitos de los mosquitos Aedes, con menos pasos. Aunque nuestro interés particular se encuentra en la caracterización de las poblaciones de hemocitos en los mosquitos Aedes, creemos que esta técnica se puede aplicar a los grupos de mosquitos otros después de los ensayos iniciales se llevan a cabo para determinar los volú…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a John Frey y Ben Peterson para la cría de mosquitos. También queremos agradecer a Christine Davis y Gary Radice para ayudar con las micrografías hemocitos. Esta investigación fue financiada por la Universidad de Richmond Arte y Ciencia de becas de verano para AA Qayum y la facultad de conceder A. Telang.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) |
Sutter Instrument | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
