Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em
Summary
Une méthode précise encore simplifiée pour collecter et tacher hémocytes de moustique est décrite. Notre méthode combine la simplicité de la perfusion avec la précision des techniques d'injection élevée pour isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes. Cette méthode facilite la connaissance des études nécessitant des types d'hémocytes et leur abondance.
Abstract
Les moustiques sont vecteurs d'un certain nombre d'agents pathogènes comme le virus de la fièvre jaune, les parasites du paludisme et de filaires. Les laboratoires sont enquêter anti-pathogènes des composants du système immunitaire inné des espèces vecteurs de maladies dans l'espoir de générer des moustiques transgéniques qui sont réfractaires aux agents pathogènes comme 1, 2. Le système immunitaire inné des moustiques se compose de plusieurs lignes de défense 3. Les pathogènes qui parviennent à échapper à la barrière imposée par le moustique épithélium bordée intestin 4 Entrez l'hémolymphe et de rencontre hémocytes circulant, d'importants composants cellulaires et les pathogènes qui encapsulent engloutir 5, 6. Les chercheurs n'ont pas trouvé de preuves pour les tissus hématopoïétiques chez les moustiques et les preuves actuelles suggèrent que le nombre d'hémocytes est fixé à l'émergence des adultes et des numéros peuvent en fait diminuer à mesure que l'âge des moustiques 7. La capacité à percevoir et identifier les hémocytes d'insectes d'importance médicale est une étape essentielle pour les études de l'immunité cellulaire. Cependant, la petite taille des moustiques et du volume limité d'hémolymphe posent un défi à la collecte de cellules immunitaires.
Deux méthodes établies pour la collecte des moustiques hémocytes notamment l'expulsion de l'hémolymphe d'une coupe proboscis 8, et le déplacement de volume (perfusion), dans lequel une solution saline est injectée dans la région membraneuse necklike entre la tête et du thorax (c'est à dire, du col utérin) et l'hémolymphe perfusés sont collectées d'une ouverture déchirée dans une région distale de l'abdomen 9, 10. Ces techniques sont cependant limitées par faible récupération des hémocytes et une possible contamination par des cellules de graisse du corps, respectivement 11. Plus récemment, une méthode appelée injection haute / Récupération améliorée d'immunocytes par l'utilisation de tampons anti-coagulant, tout en réduisant les niveaux d'échelles et de contaminer les tissus internes 11. Bien que cette méthode permet une meilleure méthode de collecte et de conservation hémocytes pour la culture primaire, il comporte un certain nombre d'injection et les étapes de collecte qui ne sont pas nécessaires si l'objectif est de recueillir l'aval, fixer et colorer hémocytes pour les diagnostics. Ici, nous démontrons notre méthode de collecte des moustiques hémolymphe qui allie la simplicité de la perfusion, l'aide de tampons anticoagulant en place d'une solution saline, avec la précision des techniques d'injection élevée pour isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes.
Protocol
Discussion
La méthode de collecte hémocytes décrite ici est modifiée à partir des méthodes précédemment publiées et permet d'isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes avec moins d'étapes. Bien que notre intérêt particulier réside dans la caractérisation des populations hémocytaires moustiques du genre Aedes, nous pensons que cette technique peut être appliquée à des groupes de moustiques d'autres, après les premiers essais sont effectués pour déterm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs tiens à remercier John Frey et Ben Peterson pour l'élevage de moustiques. Nous remercions également Christine Davis et Gary Radice de l'aide pour micrographies hémocytaires. Cette recherche a été financée par l'Université de Richmond Arts & Sciences bourse d'été aux AA et les professeurs Qayum accorder à A. Telang.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) |
Sutter Instrument | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research | MINJ-4 |
References
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