43 분자 타겟까지 동시 검출을위한 저렴, 높은 처리량 방법을 설명합니다. mPCR / RLB의 응용은 미생물 입력 및 임상 샘플에서 여러 병원균의 감지를 포함합니다.
멀티 플렉스 PCR / 역방향 라인 얼룩 하이브리드화 분석을 다시 사용할 수있는 나일론 막에 프로브 하이브 리다이 제이션 다음 한 멀티 플렉스 PCR 반응을 사용하여 43 샘플 43 분자 타겟까지 검색하실 수 있습니다. 프로브는 세포막에 고정을 허용하도록 수정 5 '아민 있습니다. Primers은 streptavidin – 퍼옥시데이즈 및 감광성의 영화를 통해 chemiluminescent 기판을 사용하여 hybridized PCR 제품의 검출을 허용 5 '비오틴 수정됩니다. 낮은 설치 및 소모품 비용이 기술은 저렴 (약 미국 2달러 샘플 당), 높은 처리량 (여러 세포막을 동시에 처리할 수)과 짧은 처리 시간 (약 10 시간)입니다.
기술은 여러 가지 방법으로 활용하실 수 있습니다. 여러 프로브는 단일 증폭 제품 내에 순서 변화를 감지하기위한 수 또는 여러 개의 제품은 후속 검색에 사용 하나 (혹은 이상) 프로브로 동시에 증폭하실 수 있습니다. 두 방법의 조합은 하나의 분석 시간에도 사용할 수 있습니다. 단일 대상 시퀀스에 대해 여러 프로브를 포함하는 능력은 분석은 매우 구체적인 수 있습니다.
mPCR / RLB의 게시 응용 프로그램 methicillin – 내성 포도상 구균 3-5과 살모넬라균 SP 6, 연쇄상 구균 pneumoniae 7,8, 연쇄상 구균 agalactiae 9 enteroviruses 10,11, 신분의 분자 serotyping의 타이핑, 항생제 저항 유전자의 1,2의 탐지를 포함 Mycobacterium SP 12, 생식기 및 호흡기 13-15 16 기타 17 병원체 및 감지 및 mollicutes 18 신분의 감지. 그러나, 기술의 융통성은 응용 프로그램이 거의 무한하고 미생물의 분자 분석에 국한되지 않습니다 것을 의미합니다.
mPCR / RLB에서 5 단계) 프리머 및 프로브 디자인, B) DNA 추출 및 PCR 증폭 C) 막의 작성, D) 하이브 리다이 제이션 및 감지되며, 분리막의 E) 리제.
mPCR / RLB 방법은 PCR의 amplicons 다수의 동시 감지를 허용합니다. 때문에 chemiluminescent 프로브 기반 탐지의 높은 감도의 프라이머 쌍 다수와 함께 하나의 멀티 플렉스 PCR 반응은 DNA 템플릿을 증폭하는 데 사용할 수 있습니다.
더 프로브 신호가 남아있는 PCR 제품과 겔 전기 영동을 수행하는 하나 이상의 샘플과 취득이 없으면 문제가 PCR의 증폭이나 프로브 하이브 리다이 제이션과 함께인지 여부를 구별할 수 있습니다. 멤브레인 모든 프로브 신호가 약하거나 부재하지만, 겔 전기 영동이 성공적으로 PCR 증폭을 나타냅니다 어디에, 가능성은 멤브레인의 상표 문제, 이전에 사용 후 막의 잘못된 재생, 하이브리드화 또는 streptavidin 부화하는 동안 잘못된 온도, 또는 결함이 포함 streptavidin을 퍼옥시데이즈의 공액 또는 검출 시약.
컨트롤 샘플 개별 프로브가 거짓 부정적인 신호, 젤 기반 감지 및 이후의 시퀀싱과 함께 하나의 PCR은 PCR 제품의 증폭을 확인하고 프로브 바인딩 사이트에서 순서 변화를 찾는 수행할 수 있습니다 생산있을 수 나타내는 경우. 약하거나 부재 프로브 신호는 대형 amplicon 크기 때문일 수 있습니다 : 가능하면 모든 amplicons 비슷한 길이 미만 300 BP의해야합니다. amplicons의 보조 DNA 구조는 또한 가난한 프로브 바인딩을 생산 수 있으며, primers의 다시 디자인을 할거 수 있습니다. 개인 프라이머 또는 프로브 농도는 신호의 강도를 최적화하기 위해 다양한 수 있습니다.
nonamplified primers 또는 뇌관 이합체 – 제품의 바인딩 프로브에 의한 거짓 긍정적인 신호는 젤 기반 감지 및 이후의 시퀀싱과 함께 하나의 PCR를 수행하여 조사 수 있습니다. 이런 경우, necessitated 수있는 프로브의 재설계. 프로브 구속력이 사이트에 포인트 돌연변이 약하거나 결석 신호가 발생할 수 있습니다. 각각의 증폭 제품의 두 가지 프로브를 허용하면 검색이 쉽습니다. 이 특성은 신중 뇌관 및 대상 DNA의 작은 시퀀스 변화를 감지 프로브 디자인으로 악용될 수 있습니다.
사용 가능한 제품 검색 다음의 멀티 플렉스 PCR 반응의 많은 방법이 있지만 요약, mPCR / RLB 낮은 설정 – 비용으로 높은 처리량과 저렴한되는 장점이 있습니다. 방법의 유연성은 어플 리케이션의 광범위한에서의 사용을 허용합니다.
The authors have nothing to disclose.
매튜 오설리번 및 페이 만주국은 호주 국립 보건 의학 연구위원회 대학원 의학 연구 장학금을받는 수 있습니다.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
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Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.