哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ
Summary
このプロトコルは、培養細胞に付着している細菌のコロニー形成単位の数を数えるに構成された単純な細菌の接着アッセイです。アッセイは堅牢であり、アドヘシンの独立は学び、数多くのバリエーションが細菌性病因に取り組む多くのラボで使用されています。
Abstract
感染症を引き起こすために、細菌はそのホストを植民地化する必要があります。細菌性病原体は、細胞1をホストするために添付ファイルを促進することができる様々な分子や構造を表現する。これらのアドヘシンは、宿主細胞表面の受容体や細菌と宿主との間のブリッジとして機能する可溶性タンパク質との相互作用に依存しています。接着前の侵略および/または毒素の分泌に重要な第一歩であり、したがってそれは、細菌性病因で検討する重要なイベントです。さらに、付着した細菌は、しばしば絶妙に微調整された細胞応答を誘導する、の研究は"細胞の微生物学2'のフィールドに出産を与えている。細菌宿主細胞上の接着とその侵略のための堅牢なアッセイは、したがって、細菌性病因の研究において重要な役割を果たし、長い多くの先駆者の研究室3,4で使用されている。これらのアッセイは、現在、細菌性病因に取り組む多くのラボで実践されています。
ここで、我々は、特定のアドヘシンの寄与を示す標準の遵守のアッセイを説明します。我々は、 大腸菌の菌株2787年5、拡散粘着（AIDA）に関与するautotransporterアドヘシンを発現するヒト病原性の菌株を使用してください。コントロールとして、我々 は 、AIDA遺伝子、2787Δ アイーダ （F.バーサウムとM.モーレス、未発表）、およびE.の商用実験室株を欠く変異株を使用大腸菌 、C600（New England Biolabs社）。細菌は一般的に使用されるHEP – 2のヒト上皮細胞株からの細胞に付着して残っている。このアッセイは、以下の広範囲に6日までに記載されている。
Protocol
Discussion
このプロトコルは、（ゲンタマイシン保護アッセイ3を使用など）の侵入を研究するように変更することができる標準的な細菌付着アッセイを説明します。コロニー形成単位の計数は、ギムザ染色などの顕微鏡下での標準的な可視化技術に依存するアプローチは、との比較により、定量化が可能になります。後者は、密着性の定性的なビューを提供しますが、接着の様々なパターンを?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らの研究室での作業は、カナダ自然科学工学研究評議会、健康研究のカナダ研究所、およびカナダリサーチチェアプログラムからの補助金によってサポートされています。 JLは、フォンデルシェルシュエンサンテケベックからの資金提供を通じて、GroupeドールエチュードデProtéines Membranaires（GEPROM）からフェローシップでサポートされています。
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose DMEM | GIBCO-Invitrogen | 12430-054 |
| DDPBS | GIBCO-Invitrogen | 14190-144 |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO-Invitrogen | 15140-148 |
| 24 well plates | Corning | 3337 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E. Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
