In vitro-analys av bakteriell vidhäftning på däggdjur epitelceller
Summary
Detta protokoll är en enkel bakterie vidhäftning analysen består i att räkna antalet bakterier kolonibildande enheter som följs på odlade celler. Analysen är robust, studerade oberoende av adhesin, och många varianter används i de flesta laboratorier som arbetar på bakteriell patogenes.
Abstract
Att orsaka infektioner måste bakterier kolonisera sin värd. Sjukdomsalstrande bakterier uttrycka olika molekyler eller strukturer kan främja anknytning till värdceller 1. Dessa adhesinerna förlitar sig på interaktion med ytan värdcell receptorer eller lösliga proteiner fungerar som en bro mellan bakterier och värd. Vidhäftning är ett avgörande första steg före invasionen och / eller utsöndring av toxiner, därför är det en viktig händelse som ska studeras i bakteriell patogenes. Dessutom följs bakterier inducerar ofta utsökt finjusteras cellulära svaren, de studier som har fött på "cellulär mikrobiologi" 2. Robust testmetoder för bakteriell vidhäftning på värdceller och deras invasion spelar därför en nyckelroll i bakteriell patogenes studier och har länge använts i många pionjär laboratorier 3,4. Dessa analyser är nu praktiseras av de flesta laboratorier arbetar på bakteriell patogenes.
Här beskriver vi en standard följs analys visar bidraget från en viss adhesin. Vi använder Escherichia coli stam 2787 5, en humanpatogena stam uttrycka Autotransporter Adhesin Deltar i Diffus Anslutning (AIDA). Som en kontroll, använder vi en mutant stam saknar aida genen, 2787Δ aida (F. Berthiaume och M. Mourez, opublicerat), och ett kommersiellt laboratorium stam av E. coli, C600 (New England Biolabs). Bakterierna är kvar att följa celler från vanliga HEp-2-mänskliga epitelceller linje. Denna analys har varit mindre utförligt beskrivits tidigare 6.
Protocol
Discussion
Detta protokoll beskriver en vanlig bakteriell följsamhet analys som kan ändras för att studera invasion (t.ex. med gentamicin skydd analys 3). Räkningen kolonibildande enheter tillåter kvantifiering, i jämförelse med metoder beroende på standard visualiseringstekniker under ett mikroskop, som Giemsa färgning. Den senare ger endast en kvalitativ bild av vidhäftning, men är ofta ett bra komplement eftersom det kan skilja olika mönster av vidhäftning och ger mechanistical insikter 9. Til…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet i laboratorier av författarna stöds av bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada, Kanada Institutes of Health Research, och Kanada forskning Stolar programmet. JL stöds av ett stipendium från Groupe d'Étude des Protéines Membranaires (GEPROM) genom finansiering från Fonds de Recherche en Santé du Quebec.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose DMEM | GIBCO-Invitrogen | 12430-054 |
| DDPBS | GIBCO-Invitrogen | 14190-144 |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO-Invitrogen | 15140-148 |
| 24 well plates | Corning | 3337 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E. Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
