نوع التحاليل الكمية للجميع الأنفلونزا من Hemagglutinins الفيروسية وNeuraminidases باستخدام الاجسام المضادة العالمي في فتحة بسيطة فحوصات لطخة
Summary
وقد وضعت وصمة فتحة بسيطة طريقة لتقدير حجم راصة دموية الأنفلونزا الفيروسية والنيورامينيديز باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف الجميع متواليات الأكثر حفظا تم تحديدها من خلال تحليل المعلومات البيولوجية. قد يكون هذا النهج المبتكرة توفر بديلا مفيدا لتحديد الكمي للجميع راصة دموية الفيروسية والنورامينيداز.
Abstract
راصة دموية (HA) والنورامينيداز (NA) واثنين من البروتينات السطحية فيروسات الانفلونزا التي هي معروفة للعب أدوار مهمة في دورة الحياة الفيروسية وتحريض واقية 1،2 الاستجابات المناعية. والهدف الرئيسي لتحييد الأجسام المضادة ، ويستخدم حاليا HA باعتبارها قوة علامة لقاحات الأنفلونزا ويقاس بواسطة المناعي الشعاعي واحد (SRID) 3. ومع ذلك ، فإن اعتماد SRID على توافر الأمصال الضدية المقابلة سلالة معينة يؤدي إلى الحد الأدنى من 2-3 أشهر من التأخير من اجل الافراج عن كل لقاح جديد. علاوة على ذلك ، على الرغم من الأدلة التي NA يدفع أيضا مناعة وقائية 4 ، ومبلغ NA في لقاحات الأنفلونزا ليست موحدة حتى الآن بسبب عدم وجود الكواشف التحليلية المناسبة أو الأسلوب 5. وهكذا ، وطرق بديلة قادرة على تحديد كمية بسيطة HA و NA المستضدات المرغوب فيه الإفراج السريع ، وتحسين مراقبة جودة لقاحات الأنفلونزا.
وقد تم تحديد مناطق الحفظ عالميا في جميع الأنفلونزا A HA المتاحة ومتواليات بواسطة NA التحليلات المعلوماتية الحيوية 6-7. وقد تم تحديد سلسلة واحدة (تسمى يوني – 1) في حاتمة فقط الحفظ عالميا HA ، والانصهار الببتيد 6 ، في حين تم التعرف على اثنين من متواليات المحفوظة في neuraminidases ، واحدة بالقرب من موقع نشط الأنزيمية (تسمى HCA – 2) و أخرى على مقربة من محطة – N (تسمى HCA – 3) 7. وتوليفها مع هذه الببتيدات تسلسل الأحماض الأمينية وتستخدم لتحصين الأرانب لإنتاج الأجسام المضادة. والجسم المضاد ضد حاتمة يوني – 1 هكتار قادرة على ربط إلى 13 ألف هكتار من الأنواع الفرعية (H1 – H13) في حين أن الأجسام المضادة أنفلونزا ضد HCA – 2 – 3 وHCA مناطق NA كانت قادرة على ربط جميع NA 9 أنماط فرعية. وأظهرت جميع الأجسام المضادة ضد خصوصية ملحوظة في تسلسل الفيروسي كما يتضح من ملاحظة أن تم الكشف عن أي عبر تفاعل البروتينات إلى السقاء. ثم استخدمت هذه الأجسام المضادة عالمية لتطوير المقايسات صمة فتحة لقياس HA و NA في لقاحات الأنفلونزا دون الحاجة للأمصال مضادة محددة 7،8. وطبقت على عينات لقاح غشاء PVDF باستخدام جهاز لطخة فتحة مع المعايير المرجعية المخفف لتركيزات مختلفة. للكشف عن HA ، تم تخفيفه واول عينات قياسية في تريس – مخزنة المالحة (TBS) التي تحتوي على اليوريا في حين 4M لقياس NA أنها كانت مخففة في TBS تحتوي على 0.01 ٪ كما Zwittergent هذه الظروف تحسنت بشكل ملحوظ لحساسية الكشف. في أعقاب الكشف عن المستضدات وHA NA بواسطة immunoblotting مع الأجسام المضادة على الصعيد العالمي منها ، وكانت إشارة من كميا شدة كثافة. ثم حسبت كميات من HA و NA في اللقاحات باستخدام منحنى القياسية التي أقيمت مع شدة إشارة لتركيزات مختلفة من المراجع المستخدمة.
بالنظر إلى أن هذه الأجسام المضادة ربط الحواتم العالمية في HA أو NA ، يمكن للمحققين المهتمة استخدامها كأدوات بحث في المناعية الأخرى من لطخة فتحة فقط.
Protocol
Discussion
تحديد كمي لHA الأنفلونزا الفيروسية وNA بالغة الأهمية بالنسبة لبحوث اللقاحات والتنمية منذ هذه البروتينات السطحية هما أهم عناصر فيروسية حفز الاستجابات المناعية 6-11. الطرق المناعية ذكرت سابقا للكشف عن هذه البروتينات الأجسام المضادة تتطلب سلالة معينة. وصمة فتحة بس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر السيدة مونيكا Tocchi لمراجعة تحريرية للمخطوطة. ويدعم AMH بواسطة منحة من جامعة الملك عبدالعزيز ، عن طريق المكتب الثقافي السعودي في كندا العربي.
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF Filter paper | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
| Vacuum pump | Millipore | WP6111560 | |
| Chemiluminescence BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Gel Documentation System | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7. | |
| Influenza vaccine reference antigen | CBER/FDA or NIBSC | ||
| Influenza vaccine samples | Commonly available in most countries | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 Detergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated | Thermo Scientific | 31460 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Scientific | 34075 |
References
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M. The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency. Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).
- Sylte, M. J., Suarez, D. L. Influenza neuraminidase as a vaccine antigen. Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).
- Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).
- Chun, S. Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins. Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).
- Gravel, C. Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences. Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).
- Li, C. A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide. Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).
- Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1). Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).
- Li, C. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 38, 284-289 (2010).
- Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition. Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).
- Hashem, A. Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus. Biochem Biophys Res Comm. , (2010).
