ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ
Summary
שיטה פשוטה כתם חריץ פותחה עבור כימות של hemagglutinin שפעת ויראלי neuraminidase באמצעות נוגדנים אוניברסלי מיקוד רצפים שימור ביותר שלהם מזוהה באמצעות ניתוחים ביואינפורמטיקה. גישה חדשנית זו עשויה לספק חלופה שימושי להגדרה כמותית של hemagglutinin כל נגיפיים neuraminidase.
Abstract
Hemagglutinin (HA) ו neuraminidase (NA) הם שני חלבונים פני השטח של נגיפי שפעת אשר ידועים תפקיד חשוב במחזור החיים ויראלי הגיוס של 1,2 התגובות מגן החיסון. כאשר המטרה העיקרית נוגדנים מנטרלים, HA משמש כיום גם את הסמן חיסון שפעת הפוטנציאל נמדדת immunodiffusion רדיאלי יחיד (SRID) 3. עם זאת, התלות של SRID על הזמינות של antisera המקביל תת ספציפיים הגורמים מינימום של 2-3 חודשים עיכוב לשחרורו של חיסון כל חדש. יתר על כן, למרות העדויות כי NA גם גורם החסינות 4, כמות NA בחיסונים לשפעת אינה סטנדרטית אך בשל חוסר של ריאגנטים המתאימים או שיטה אנליטית 5. לכן, שיטות חלופיות פשוט מסוגל לכימות אנטיגנים HA ו NA רצויות לשחרור מהיר, בקרת איכות טובה יותר של החיסונים לשפעת.
אזורים שמורים אוניברסלי ב שפעת כולם זמינים HA ו NA רצפים זוהו על ידי מנתח ביואינפורמטיקה 6-7. אחת ברצף (יועד Uni-1) זוהה epitope רק את נשמרת אוניברסלית של HA, הפפטיד היתוך 6, בעוד שני רצפים שימור זוהו neuraminidases, אחד קרוב באתר הפעיל האנזימטית (יועד HCA-2) ואת קרובים אחרים הסופית-N (יועד HCA-3) 7. פפטידים אלו רצפים של חומצות אמיניות היו מסונתז ומשומשים לחסן ארנבות לייצור נוגדנים. נוגדנים נגד epitope Uni-1 של HA היה מסוגל להיקשר 13 subtypes של שפעת A HA (H1-H13) ואילו נוגדנים נגד HCA-2 ו HCA-3 אזורים של NA היו מסוגלים מחייב את כל 9 תת NA. כל הנוגדנים הראו סגוליות מדהים נגד רצפים ויראלי כפי שמעידים התצפית שלא לחצות תגובתיות לחלבונים allantoic זוהה. נוגדנים אלה אוניברסלי שימשו אז לפתח כתם מבחני חריץ לכמת HA ו NA של שפעת חיסונים ללא צורך antisera ספציפי 7,8. דגימות חיסון יושמו על קרום PVDF באמצעות מנגנון כתם חריץ יחד עם סטנדרטים התייחסות בדילול לריכוזים שונים. לצורך זיהוי של HA, דגימות תקן היו בדילול הראשון טריס שנאגרו מלוחים (TBS) המכיל אוריאה 4M בעוד למדידת NA הם מדולל TBS המכילה 0.01% Zwittergent התנאים האלה שיפרה בצורה משמעותית את רגישות הזיהוי. בעקבות גילוי של HA ו NA על ידי אנטיגנים immunoblotting עם נוגדנים אוניברסלי שלהם, בעוצמות האות היו לכמת ידי צפיפות. סכומי HA ו NA בחיסונים חושבו לאחר מכן באמצעות עקומת סטנדרט הוקמה עם עוצמות אות הריכוזים השונים של הפניות בשימוש.
בהתחשב בכך נוגדנים אלה נקשרים epitopes אוניברסלי HA או NA, החוקרים מעוניינים יכול להשתמש בהם ככלי מחקר immunoassays מלבד כתם חריץ בלבד.
Protocol
Discussion
קביעה כמותית של שפעת נגיפית HA ו NA הם קריטיים עבור מחקר ופיתוח החיסון שכן אלה שני חלבונים פני השטח הם מרכיבים נגיפיים החשוב ביותר גרימת התגובה החיסונית 6-11. שיטות אימונולוגיות דיווחו בעבר לצורך זיהוי של חלבונים אלה דורשים מאמץ נוגדנים ספציפיים. כתם פשוט, לשחזור מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לגברת מוניקה Tocchi לבדיקה העריכה של כתב היד. AMH הוא נתמך על ידי מלגה מהמלך Abdulaziz University, דרך סעודיה תרבות הלשכה בקנדה.
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF Filter paper | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
| Vacuum pump | Millipore | WP6111560 | |
| Chemiluminescence BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Gel Documentation System | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7. | |
| Influenza vaccine reference antigen | CBER/FDA or NIBSC | ||
| Influenza vaccine samples | Commonly available in most countries | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 Detergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated | Thermo Scientific | 31460 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Scientific | 34075 |
References
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M. The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency. Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).
- Sylte, M. J., Suarez, D. L. Influenza neuraminidase as a vaccine antigen. Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).
- Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).
- Chun, S. Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins. Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).
- Gravel, C. Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences. Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).
- Li, C. A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide. Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).
- Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1). Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).
- Li, C. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 38, 284-289 (2010).
- Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition. Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).
- Hashem, A. Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus. Biochem Biophys Res Comm. , (2010).
