Preparazione delle condizioni di vita isolata fotorecettori dei Vertebrati per l'imaging di fluorescenza
Summary
Un metodo è descritto per la preparazione di singole cellule fotorecettori che vivono da diverse specie di vertebrati per l'imaging di fluorescenza. Il metodo può essere utilizzato per l'immagine della fluorescenza di fluorofori endogeni, come la NADH o vitamina A, o quella di esogena coloranti aggiunti fluorescenti sensibili a Ca<sup> 2 +</sup> O altri fattori.
Abstract
Nella retina dei vertebrati, fototrasduzione, la conversione della luce in un segnale elettrico, è effettuata dal bastone e coni fotorecettori 1-4. Bastoncelli sono responsabili della visione in penombra, i coni di luce. Fototrasduzione avviene nel segmento esterno della cellula fotorecettore, un comparto specializzato che contiene un'alta concentrazione di pigmento visivo, il rilevatore di luce principale. Il pigmento visivo è composto da un cromoforo, 11 – cis retinico, attaccato ad una proteina, opsina. Un fotone assorbito dal pigmento visivo isomerizza il cromoforo da 11 – cis a tutto-trans. Questo fotoisomerizzazione determina un cambiamento conformazionale nel pigmento visivo che avvia una cascata di reazioni che culmina in un cambiamento di potenziale di membrana, e determinando la trasduzione dello stimolo della luce in un segnale elettrico. Il recupero della cellula da stimolazione luminosa comporta la disattivazione degli intermedi attivati dalla luce, e il ripristino del potenziale di membrana. Ca 2 + modula l'attività dei diversi enzimi coinvolti nella fototrasduzione, e la sua concentrazione è ridotta alla stimolazione luminosa. In questo modo, Ca 2 + gioca un ruolo importante nel recupero della cellula da stimolazione luminosa e il suo adattamento alla luce di fondo.
Un'altra parte essenziale del processo di recupero è la rigenerazione del pigmento visivo che è stato distrutto durante la luce il rilevamento da parte dei suoi fotoisomerizzazione 11 – cromoforo cis a tutto-trans 5-7. Questa rigenerazione inizia con il rilascio di tutti-trans retinico dal pigmento fotoattivati, lasciandosi alle spalle l'apo-proteina opsina. La rilasciato all-trans retinico è rapidamente ridotto in una reazione che utilizza NADPH a tutto-trans retinolo e opsina combina con fresca 11 – retina cis portato nel segmento esterno di riformare il pigmento visivo. All-trans retinolo viene poi trasferito al di fuori del segmento esterno e nelle celle attigue dalla proteina specializzata retinoidi Interphotoreceptor vettore Binding (IRBP).
Imaging di fluorescenza di cellule fotorecettrici singolo può essere usato per studiare la loro fisiologia e biologia cellulare. Ca 2 +-sensitive coloranti fluorescenti possono essere utilizzate per esaminare in dettaglio l'interazione tra il segmento esterno Ca 2 + modifiche e risposta alla luce 8-12 così come il ruolo del segmento Ca 2 + interna negozi a Ca 2 + omeostasi 13,14 . Coloranti fluorescenti possono essere utilizzati anche per misurare la concentrazione di Mg 2 + 15, pH, e come traccianti di acquosa e scomparti membrana 16. Infine, la fluorescenza intrinseca di all-trans retinolo (vitamina A) può essere utilizzato per monitorare la cinetica della sua formazione e la rimozione delle cellule fotorecettori singolo 17-19.
Protocol
Discussion
Se sano cellule isolate non si ottengono, il problema è sia con l'isolamento o la salute della retina o con il suo taglio. Di solito, dopo aver rimosso la parte anteriore dell'occhio e il vitreo, la retina ascensori prontamente spento l'epitelio pigmentato. Se non lo fa, cerca di non staccare a partire dalla periferia del oculare. Se è ancora difficile separare, una possibilità probabile è che l'animale non è stata adattata al buio per un adeguato periodo di tempo, o la luce rossa è troppo luminoso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato da NEI concedere EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y. Vertebrate Photoreceptors. Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in Vertebrate Photoreceptors. Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).
- Palczewski, K. G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin. Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. 생화학. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. 생화학. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
