कैंसर कोशिकाओं द्वारा Endothelial सेल monolayer के आक्रमण उपाय करने के लिए एक वास्तविक समय विद्युत प्रतिबाधा आधारित तकनीक

Summary

यह लेख एक का वर्णन<em> इन विट्रो में</emEndothelial कोशिकाओं की एक monolayer के माध्यम से हमलावर निगरानी कैंसर कोशिकाओं के लिए> तकनीक. डेटा अच्छी तरह तल पर इलेक्ट्रोड की सतह पर प्रतिबाधा में परिवर्तन के एक समारोह के रूप में वास्तविक समय में प्राप्त कर लिया है.

Abstract

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host^1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors^4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process⁶. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.

Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes^7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance^9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.

The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

Protocol

1. तैयारी सभी चरणों का एक टिशू कल्चर हुड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. xCELLigence स्टेशन 5% सीओ 2 की उपस्थिति में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है. पारित होने के 6 से अधिमानतः अधिक नहीं कम बीतने HUVEC कोशिकाओं का उपयोग करें. इसके अलावा, कोशिकाओं को कोई अधिक फसल का समय मिला हुआ% 75 से अधिक कर रहे हैं सुनिश्चित करें. HUVEC कोशिकाओं की वृद्धि कारकों की आपूर्ति करता है और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त ईजीएम -2 बुलेट किट (Lonza बायोसाइंसेज) के साथ पुनर्गठन ईजीएम -2 मीडिया में बड़े हो रहे हैं. Trypsin के सभी निशान, 200xg पर कोशिकाओं कताई पीबीएस के साथ एक बार धोने, और संकेत सेल घनत्व उन्हें resuspending द्वारा सेल निलंबन से हटाया जाना चाहिए. 37 पर 1 घंटे के लिए जिलेटिन 0.1% के साथ कोट xCELLigence ई प्लेट 16 डिग्री सेल्सियस या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ प्लेट धो और 100μL पुनर्गठन ईजीएम -2 मीडिया जोड़ें. पृष्ठभूमि को मापने के लिए xCELLigence सिस्टम पर एक रिक्त पढ़ने प्रदर्शन करनाकोशिकाओं के अभाव में प्रतिबाधा. 2. HUVEC monolayer के सृजन Trypsinization द्वारा HUVEC कोशिकाओं के एक उप मिला हुआ फ्लास्क हार्वेस्ट. 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम घनत्व के पुनर्गठन ईजीएम -2 मीडिया में Resuspend कोशिकाओं. 100μL ईजीएम -2 मीडिया वाले ई थाली calibrated एक पृष्ठभूमि के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए, HUVEC सेल निलंबन (2.5 एक्स 10 4 HUVEC कोशिकाओं) के 100μL जोड़ें. तुरंत xCELLigence साधन में ई प्लेट स्थापित करें. कार्यक्रम xCELLigence सॉफ्टवेयर 10 मिनट के अंतराल पर प्रतिबाधा रीडिंग प्रदर्शन करने के लिए. वे एक monolayer फार्म तक endothelial कोशिकाओं के रूप में (चित्रा 2) सेल सूचकांक के एक सपाट इसका सबूत है, 18-21 घंटे के लिए हो जाना. 3. कोशिकाओं और डेटा सामान्य बनाने पर हमले के अलावा के. एक बार एक स्थिर HUVEC monolayer की एक अंतिम भट को trypsinization और resuspend द्वारा फसल ट्यूमर कोशिकाओं, का गठन किया है1 x 10 5 कोशिकाओं / ट्यूमर कोशिकाओं (जैसे RPMI या DMEM मीडिया 10% FBS युक्त) के रूप में विकसित करने के लिए प्रयोग किया जाता मीडिया में मिलीलीटर के अल्पसंख्यक रोकें प्रतिबाधा xCELLigence सॉफ्टवेयर पर रीडिंग और स्टेशन से ई प्लेट हटा दें. आकांक्षा द्वारा ईजीएम -2 मीडिया निकालें. 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं से युक्त ट्यूमर सेल निलंबन की 100μL जोड़ें. आम तौर पर, ट्यूमर कोशिकाओं की एक 1:2.5 अनुपात: endothelial कोशिकाओं वरीयता प्राप्त, परख के लिए सबसे अच्छा काम करता है. हालांकि, अनुपात व्यक्तिगत सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इनक्यूबेटर में xCELLigence सिस्टम पर ई थाली प्लेस और 10 मिनट के अंतराल पर प्रतिबाधा रीडिंग जारी है. आक्रमण ट्यूमर कोशिकाओं पर हमला करने से endothelial जंक्शनों और पैठ के त्याग के कारण सेल सूचकांक में एक बूंद के रूप में अगले 6-12 घंटे से अधिक वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है. ट्यूमर कोशिकाओं पर हमला करने के अलावा समय के लिए परिणामों को मानक के अनुसार. xCELLigence सॉफ्टवेयर किसी भी समय बिंदु और परिणाम को सामान्य बनाने के लिए परमिटसीधे सॉफ्टवेयर विंडो में देखा जा सकता है. 4. प्रतिनिधि परिणाम: Metastatic और गैर metastatic कोशिकाओं द्वारा HUVEC monolayer के आक्रमण का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. K7M2 एक metastatic ऑस्टियो सार्कोमा सेल लाइन है. इन कोशिकाओं को इस सेल लाइन 13,14 के आक्रामक गुण के लिए खातों, cytoskeletal linker प्रोटीन एज़रिन के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं. HUVEC कोशिकाओं K7M2 कोशिकाओं के साथ चुनौती दी है, 6 घंटे के भीतर बिजली के प्रतिरोध में एक बूंद है. विद्युत प्रतिरोध में यह ड्रॉप हमलावर ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा HUVEC monolayer के आक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है. K12 सेल लाइन, दूसरे हाथ पर, एज़रिन की बहुत कम स्तर व्यक्त किया और 13 फलस्वरूप कम मेटास्टेटिक है. कोशिकाओं का पालन या HUVEC monolayer (चित्रा 3) के माध्यम से आक्रमण करने में असमर्थ हैं के रूप में प्रतिरोध में एक कम खड़ी ड्रॉप में K12 कोशिकाओं परिणामों के साथ HUVEC monolayer की चुनौती. <imgsrc = "/ files/ftp_upload/2792/2792fig1.jpg" alt = "चित्रा 1" /> चित्रा 1. ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा endothelial कोशिकाओं के आक्रमण के लिए काम प्रवाह प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख. HUVEC कोशिकाओं जिलेटिन लेपित ई प्लेटों पर चढ़ाया और एक मिला हुआ monolayer के फार्म करने के लिए अनुमति दी जाती है. एक monolayer का गठन किया है और सेल सूचकांक endothelial monolayer के आक्रमण के कारण परिवर्तन के रूप में आक्रमण वास्तविक समय में निगरानी रखी जाती है एक बार घातक कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं. चित्रा 2. HUVEC monolayer के गठन. HUVEC कोशिकाओं को देते हैं और जिलेटिन लेपित सोने इलेक्ट्रोड पर फैल के रूप में सेल सूचकांक में परिवर्तन. एक मिला हुआ monolayer के गठन के 18 घंटे के बाद सेल सूचकांक का एक स्थिरीकरण का प्रतिनिधित्व करती है. चित्रा 3. K7M2 और K12 ऑस्टियो सार्कोमा कोशिकाओं द्वारा HUVEC कोशिकाओं के आक्रमण. सेल में भारी कमीएल सूचकांक अत्यधिक metastatic K7M2 कोशिकाओं की शुरूआत के कुछ ही घंटों के भीतर होता है. K12 कोशिकाओं, दूसरे हाथ पर, कम मेटास्टेटिक हैं और के रूप में कुशलतापूर्वक K7M2 कोशिकाओं के रूप में endothelial monolayer घुसना करने में असमर्थ हैं. इस HUVEC monolayer K12 कोशिकाओं के साथ चुनौती दी है जब सेल सूचकांक में एक कम खड़ी कमी का प्रतिनिधित्व करती है. नियंत्रण कैंसर कोशिकाओं के अभाव में HUVEC monolayer के प्रतिबाधा का प्रतिनिधित्व करता है. प्रयोगों तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया.

Discussion

वास्तविक समय HUVEC आक्रमण परख निगरानी आक्रमण के लिए एक सरल, अभी तक शक्तिशाली तरीका है. यह अंत बिंदु विश्लेषण पर निर्भर अन्य परंपरागत तकनीकों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है, जो वास्तविक समय में परिणाम प्रदान करता है. परख परीक्षण दवाओं, एंटीबॉडी, ligands और मेटास्टेसिस के inhibitors या stimulators के रूप में प्रोटीन के लिए संशोधित किया जा सकता है. कैंसर / endothelial सेल पार बात पर अलग एजेंटों के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से आकलन किया जा सकता है. ऐसी संस्कृति मीडिया में वृद्धि कारक है और दवाओं के रूप में exogenous एजेंटों, शुरू करते हैं, यह वे HUVEC monolayer की अखंडता को प्रभावित नहीं करते, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. HUVEC monolayer के विघटन हमलावर कोशिकाओं के अभाव में exogenous एजेंट शुरू करने, और सेल सूचकांक में कोई बदलाव नहीं आया है कि सुनिश्चित करने के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. इस प्रकार, उचित नियंत्रण प्रयोगात्मक डिजाइन के हिस्से के रूप में शामिल किया जाना चाहिए.

वे एक conf के फार्म के रूप में अलग सेल लाइनों अलग सेल सूचकांक घटता का प्रदर्शनluent monolayer की. वक्र, साथ ही अधिकतम सेल सूचकांक प्राप्त किया, के आकार के सेल प्रकार विशिष्ट है. HUVEC कोशिकाओं 16-18 घंटे के बाद एक उच्च सेल सूचकांक में एक और स्थिरीकरण, जिसके बाद 4-6 घंटे बोने के बाद सेल सूचकांक की सपाट एक विशेषता क्षणिक दिखा. इसलिए, यह कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं के अलावा पहले कम से कम 18 घंटे के लिए एक मिला हुआ monolayer फार्म बताने के लिए महत्वपूर्ण है.

सेल सूचकांक इलेक्ट्रोड / सेल अंतरावस्था पर ईओण वातावरण पर निर्भर है, इस तरह के सेल आकारिकी और सेल सेल adhesions की गुणवत्ता के रूप में विभिन्न कारकों को कवर अच्छी तरह से नीचे के क्षेत्र के अलावा, सेल सूचकांक को प्रभावित करती है. इस प्रकार, ट्यूमर सेल आक्रमण पर होता है जो सेल सूचकांक में कमी, endothelial जंक्शनों और बाद में ट्यूमर सेल आक्रमण का त्याग शामिल हैं जो कई कारकों का एक समारोह है.

xCELLigence साधन तीन अलग अलग विन्यास में निर्मित है: वास्तविक समय सेल विश्लेषक(RTCA) सपा, RTCA सांसद और RTCA डीपी. RTCA सांसद साधन 96 अच्छी तरह से ई प्लेटें एक साथ छह लोगों को पकड़ कर सकते हैं जबकि RTCA सपा साधन एक 96 अच्छी तरह से ई प्लेट रखती है. यह दवाओं और यौगिकों के उच्च throughput प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है. इस लेख में प्रयोगों तीन 16 अच्छी तरह से ई प्लेटें पकड़ सकते हैं जो RTCA डीपी साधन का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं. प्रत्येक ई थाली पकड़े स्टेशन स्वतंत्र रूप से एकाधिक उपयोगकर्ताओं को एक साथ प्रयोगों को चलाने के लिए अनुमति देता है, संचालित किया जा सकता है. RTCA डीपी साधन भी यूके-प्लेट का उपयोग प्रवास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये 8um के एक औसत के छेद के आकार के साथ एक पॉलीथीन terephtalate (पीईटी) झिल्ली द्वारा अलग ऊपरी और निचले कक्षों के साथ 16 अच्छी तरह प्लेटें हैं. इलेक्ट्रॉनिक सेंसर ऊपरी सदन के झरझरा झिल्ली के नीचे पर स्थित हैं. निचले सदन ऊपरी सदन में कोशिकाओं के लिए chemoattractant के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है. हालांकि, यूके, प्लेटों से अधिक HUVEC आक्रमण परख का एक बड़ा लाभ यह है कि पूर्व में ट्यूमर सेल आक्रमण मैंendothelial सेल आक्रमण ट्यूमर और endothelial कोशिकाओं के बीच परस्पर बात पर निर्भर करता है, ताकना आकार के द्वारा ही सीमित नहीं.

HUVEC आक्रमण परख भी एप्लाइड बायोफिज़िक्स (ट्रॉय, NY) द्वारा निर्मित, ECIS जेड साधन पर प्रदर्शन किया जा सकता है. ECIS जेड साधन सरणी और इलेक्ट्रोड विन्यास में अंतर के साथ, xCELLigence साधन के समान प्रौद्योगिकी का उपयोग. हम सफलतापूर्वक 8 अच्छी तरह से ECIS arrays का उपयोग HUVEC आक्रमण assays प्रदर्शन किया है. 2.5 एक्स 10 ⁵ और 1 x 10 ⁵ कोशिकाओं क्रमश: यह अच्छी तरह से नीचे की सतह क्षेत्र चढ़ाया होना endothelial और ट्यूमर कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है जो ECIS सरणियों में बड़ा है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
xCELLigence RTCA DP station	Roche	05469759001
RTCA control unit	Roche	05454417001	Notebook with preinstalled RTCA software
E-Plate 16	Roche	05469830001
HUVEC cells	Lonza	CC-2517
EGM-2 media	Lonza	CC-3156
EGM-2 bullet kit	Lonza	CC-4176
0.1% Gelatin in sterile H2O	Millipore	MCPROTO045