सक्रिय टी. के पुनर्गठन इन विट्रो में castaneum टेलोमिरेज
Summary
टेलोमिरेज के उत्प्रेरक सबयूनिट को अलग करने के लिए प्रयास, tert, संरचनात्मक अध्ययन के लिए पर्याप्त मात्रा में, एक दशक से अधिक के लिए सीमित सफलता के साथ मुलाकात की है. यहाँ, हम पुनः संयोजक Tribolium castaneum tert के अलगाव के लिए तरीकों वर्तमान (<em> टीसी</em> Tert) और सक्रिय के पुनर्गठन<em> टी. castaneum</em> टेलोमिरेज (RNP) ribonucleoprotein जटिल<em> इन विट्रो में</em>.
Abstract
टेलोमिरेज के उत्प्रेरक सबयूनिट को अलग करने के लिए प्रयास, tert, संरचनात्मक अध्ययन के लिए पर्याप्त मात्रा में, एक दशक से अधिक के लिए सीमित सफलता के साथ मुलाकात की है. यहाँ, हम पुनः संयोजक Tribolium castaneum tert (टीसी tert) के अलगाव और सक्रिय टी. के पुनर्गठन के लिए तरीकों वर्तमान castaneum इन विट्रो में टेलोमिरेज ribonucleoprotein जटिल (RNP).
टेलोमिरेज एक विशेष रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एक है कि कम डीएनए दोहराता है, रैखिक गुणसूत्रों 2 कि उन्हें समाप्त करने के लिए अंत संलयन और गिरावट से बचाने की सेवा के 3 'अंत करने के लिए telomeres कहा जाता है, कहते हैं. डीएनए प्रतिकृति के बाद, एक छोटी खंड 3 गुणसूत्र के अंत में और टेलोमिरेज के बिना खो दिया है, कोशिकाओं को अंततः उनके Hayflick सीमा 4 तक पहुँचने तक विभाजित जारी रखने के. इसके अतिरिक्त, टेलोमिरेज ज्यादातर वयस्कों में दैहिक 5 कोशिकाओं में निष्क्रिय है, लेकिन कैंसर कोशिकाओं 6 जहां यह सेल अमरता 7 को बढ़ावा देता है में सक्रिय है .
प्रोटीन (tert) सबयूनिट, जो एंजाइम उत्प्रेरक सबयूनिट और एक अभिन्न शाही सेना (TER) घटक है, जो शामिल हैं टेम्पलेट tert 8,9 telomeres के synthesize करने के लिए उपयोग करता है शामिल हैं: न्यूनतम टेलोमिरेज एंजाइम दो मुख्य घटकों के होते हैं. 2008 से पहले, व्यक्तिगत टेलोमिरेज डोमेन के लिए संरचनाओं केवल 10,11 हल किया गया था. इस क्षेत्र में एक बड़ी सफलता सक्रिय 12 की क्रिस्टल संरचना का निर्धारण, टी. के उत्प्रेरक सबयूनिट से आया castaneum टेलोमिरेज, टीसी 1 tert.
यहाँ, हम संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सक्रिय, घुलनशील टीसी tert, और टेलोमिरेज गतिविधि assays के लिए टेलोमिरेज इन विट्रो में RNP जटिल के पुनर्गठन की एक बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं. प्रायोगिक तरीकों का इस्तेमाल किया के एक सिंहावलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है.
Protocol
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि टी. के उत्प्रेरक सबयूनिट की बड़ी मात्रा में के उत्पादन के लिए अनुमति देता है castaneum घुलनशील, संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सक्रिय रूप में टेलोमिरेज tert. टीसी से अधिक …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुसंधान यहाँ प्रस्तुत स्वास्थ्य के पेंसिल्वेनिया विभाग, एलिसन मेडिकल, वी और पन्ना मूलाधार द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
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