Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube
Summary
Coltura di cellule normali in loro contesto tridimensionale rappresenta un metodo alternativo per studiare eventi precoci necessari per la trasformazione cellulare e tumorigenesi. Questo metodo è utilizzato per la coltivazione ovarici normali e cellule oviductal per studiare eventi precoci nella formazione del cancro ovarico.
Abstract
Il cancro ovarico è la quinta causa di decessi per cancro nelle donne e ha un tasso di mortalità del 63% negli Stati Uniti 1. Il tipo di cellula d'origine dei tumori ovarici è ancora in discussione e potrebbe essere sia l'epitelio della superficie ovarica (OSE) o l'epitelio distale del fimbrie tube di Falloppio 2,3. Coltura le cellule normali come una coltura primaria in vitro consentirà agli scienziati di modello cambiamenti specifici che potrebbero portare al cancro ovarico nell'epitelio distinti, così definitivamente la determinazione del tipo di cellula di origine. Ciò permetterà lo sviluppo di biomarcatori più precisi, modelli animali con tessuto-specifici cambia gene, e migliori strategie di prevenzione mirate a questa malattia.
Il mantenimento di cellule normali in idrogel alginato promuove a breve termine in coltura in vitro di cellule nel loro contesto tridimensionale e permette l'introduzione di DNA plasmidico, siRNA e piccole molecole. Dagli organi coltura in pezzi che sono derivati da tagli strategici con un bisturi, le culture diverse da un singolo organo può essere generato, aumentando il numero di esperimenti da un singolo animale. Questi tagli aspetti del modello di ovulazione porta alla proliferazione di OSE, che è associata alla formazione di cancro ovarico. Tipi di cellule come l'OSE, che non crescono bene su superfici in plastica possono essere coltivate con questo metodo e facilitare l'indagine nei normali processi cellulari o dei primi eventi nella formazione del cancro 4.
Idrogel alginato può essere utilizzato per sostenere la crescita di molti tipi di tessuti 5. Alginato è un polisaccaride lineare composto da unità ripetute di β-D-mannuronico acido e α-L-guluronic acido che può essere reticolato con gli ioni calcio, con una conseguente azione gelificante delicata che non danneggiano i tessuti 6,7. Come per le altre cellule matrici tridimensionali cultura come Matrigel, alginato fornisce supporto meccanico per i tessuti, ma le proteine non sono reattivi con la matrice di alginato, e quindi le funzioni alginato come matrice extracellulare sintetico che non avvia segnalazione cellulare 5. L'idrogel alginato galleggia in media standard di coltura cellulare e supporta l'architettura della crescita dei tessuti in vitro.
Un metodo viene presentato per la preparazione, la separazione, e l'inclusione di neoplasie ovariche e composizioni per organo oviductal in idrogel alginato, che possono essere mantenute in coltura per un massimo di due settimane. Il rilascio enzimatico delle cellule per l'analisi di campioni di RNA e proteine dalla cultura organo è anche descritto. Infine, la crescita di tipi di cellule primarie è possibile senza immortalizzazione genetica di topi e permette agli investigatori di utilizzare knockout e topi transgenici.
Protocol
Discussion
Lo sviluppo di un sistema tridimensionale di organi cultura utilizzando idrogel alginato rappresenta un metodo versatile per l'analisi di molti tipi di tessuto diverso da una grande varietà di organismi. L'uso di colture 3D può essere estesa ai campi della ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa in quanto fornisce una impalcatura su cui le cellule possono crescere 11. Attualmente, il nostro laboratorio è in fase di studio iniziale, usando il tessuto ovarico umano e tube di Falloppio, tuttavi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo di Ricerca sul Cancro ovarico [concedere LT/UIC/01.2011], il Centro UIC per la scienza clinica e traslazionale, il Cancer Center UIC, e il National Institutes of Health concedere C06RR15482.
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal AAALAC sotto protocolli animali approvati cura dalla cura degli animali e del Comitato Usa a UIC. Animali per questo progetto sono alloggiati in camere barriera nel Laboratorio risorse biologiche (BRL) presso l'Università dell'Illinois a Chicago. Il BRL dispone di uno staff completamente veterinario che controlla gli animali, almeno due volte al giorno e fornisce consigli sulla cura degli animali.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leibovitz L-15 medium | Gibco | 11415 | |
| αMEM medium | Gibco | 12000-022 | |
| Sodium alginate | Novamatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster Carr | 45″ wide roll; 0.0041″ opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | Gibco | |
| ITS solution | Roche | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Labs | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
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