Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Summary

Cultura de células normais em seu contexto tridimensional representa um método alternativo para estudar os eventos iniciais necessárias para a transformação celular e tumorigênese. Este método é usado para crescer ovariano normal e células oviductal para estudar os eventos iniciais na formação de câncer de ovário.

Abstract

Câncer de ovário é a quinta causa de morte por câncer em mulheres e tem uma taxa de mortalidade de 63% nos Estados Unidos ^1. O tipo de célula de origem para o câncer de ovário ainda está em questão e pode ser tanto o epitélio de superfície do ovário (OSE) ou do epitélio distal do fímbrias tuba uterina ^2,3. Cultura as células normais como uma cultura primária in vitro permitirá aos cientistas modelo de mudanças específicas que podem levar ao câncer de ovário no epitélio distintas, assim, definitivamente determinar o tipo de célula de origem. Isto irá permitir o desenvolvimento de biomarcadores mais precisos, modelos animais com alterações de tecidos específicos de genes, e das melhores estratégias de prevenção específicas para esta doença.

Manter as células normais em hidrogéis de alginato promove a curto prazo na cultura in vitro de células no seu contexto tridimensional e permite introdução de DNA plasmídeo, siRNA, e pequenas moléculas. Pelos órgãos de cultura em pedaços que são derivados de cortes estratégicos usando um bisturi, várias culturas a partir de um único órgão podem ser gerados, aumentando o número de experimentos a partir de um único animal. Estes cortes aspectos do modelo da ovulação levando a proliferação da OSE, que está associado com a formação de câncer de ovário. Tipos de células, como a OSE, que não crescem bem em superfícies de plástico podem ser cultivadas usando este método e facilitar a investigação sobre os processos celulares normais ou os primeiros eventos na formação do câncer ^4.

Hidrogéis de alginato pode ser usado para suportar o crescimento de muitos tipos de tecidos ^5. Alginato é um polissacarídeo linear composto por unidades repetitivas de ácido D-mannuronic β e α-L-ácido gulurônico que podem ser reticulados com íons de cálcio, resultando em uma ação gelificante suave que não danificar os tecidos ^6,7. Como outras matrizes tridimensionais de cultura de células, tais como Matrigel, alginato fornece suporte mecânico para os tecidos, no entanto, as proteínas não são reativos com a matriz de alginato e, portanto, funções de alginato como uma matriz extracelular sintética que não inicia sinalização celular ^5. O hidrogel de alginato flutua no meio padrão de cultura celular e suporta a arquitetura do crescimento de tecidos in vitro.

Um método é apresentado para a preparação, separação e incorporação de ovário e pedaços de órgãos oviductal em hidrogéis de alginato, que pode ser mantidas em cultura por até duas semanas. A liberação enzimática de células para análise de proteínas e amostras de RNA a partir da cultura de órgãos é também descrito. Finalmente, o crescimento de tipos de células primárias é possível sem imortalização genética de ratos e permite que os pesquisadores de usar nocaute e camundongos transgênicos.

Protocol

1. Dissecção e isolamento do tecido ovariano Preparar uma solução 0,5% (w / v) de alginato de sódio, prepare de uma versão modificada do protocolo descrito anteriormente 5, usando PBS estéril e calor a 37 ° C. Misture por inversão ou de balanço, mas não vortex. Desenhe o alginato em uma seringa de 1 ml com agulha 25 G e manter a 37 ° C. Prepare estéril 10mM CaCl 2 solução para o alginato de reticulação em encapsulamento dos tecidos e quente a 37 ° C. …

Discussion

O desenvolvimento de um sistema de cultura tridimensional de órgãos utilizando hidrogéis de alginato representa um método versátil para a análise de muitos tipos de tecidos diferentes de uma grande variedade de organismos. O uso de culturas 3D pode ser estendido para os campos da engenharia de tecidos e medicina regenerativa, pois proporciona um andaime sobre o qual as células podem crescer ^11. Atualmente, nosso laboratório está passando por estudos iniciais usando de ovário e de tecidos humanos tro…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Leibovitz L-15 medium	Gibco	11415
αMEM medium	Gibco	12000-022
Sodium alginate	Novamatrix
Sodium cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Polypropylene mesh fiber	McMaster Carr		45″ wide roll; 0.0041″ opening
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Penicillin/streptomycin	Gibco	15070-063
Alginate lyase	Sigma Aldrich	A1603
A1603	Sigma Aldrich	C9697	From Clostridium histolyticum
Bovine serum albumin	MP Biomedicals	103700
Fetal bovine serum	Gibco	Gibco
ITS solution	Roche	11074547001	Insulin/transferrin/sodium selenite
Cytokeratin 8 antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-1	Use at 1:200
DAPI	Vector Labs	H1200
Bromodeoxyuridine	Sigma	B50002-1G	Final concentration 10 μM