Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-
Summary
Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.
Abstract
O estudo da eritropoiese visa compreender como as células vermelhas são formadas a partir progenitores antes hematopoiéticas e eritróide. Especificamente, a taxa de formação de células vermelhas é regulada pelo hormônio eritropoietina (EPO), cuja síntese é desencadeada pela hipóxia tecidual. Uma ameaça aos resultados tecido adequado de oxigenação em um rápido aumento da EPO, conduzindo a um aumento na taxa de eritropoiética, um processo conhecido como a resposta ao estresse eritropoiética. O aumento resultante do número de eritrócitos melhora a entrega de oxigênio nos tecidos. Uma resposta ao estresse eficiente eritropoiética é, portanto, fundamental para a sobrevivência e recuperação de condições fisiológicas e patológicas, tais como altitude elevada, anemia, hemorragia, quimioterapia ou transplante de células-tronco.
O rato é um modelo fundamental para o estudo da eritropoiese e sua resposta ao estresse. Eritropoiese rato definitiva (do tipo adulto) ocorre no fígado fetal entre os dias embrionárias 12,5 e 15,5, no baço neonatal e adulto no baço e medula óssea. Métodos clássicos de identificação de progenitores eritróides no tecido dependem da capacidade dessas células de dar origem a colônias de células vermelhas quando banhado em Epo contendo semi-sólido mídia. Sua progênie precursor eritróide são identificados com base em critérios morfológicos. Nenhum destes métodos clássicos permitir o acesso a um grande número de células em estágio de diferenciação eritróide específicos para o estudo molecular. Aqui apresentamos um método de fluxo de citometria de identificar e estudar a diferenciação progenitores estágio-específicas e de precursores eritróides, diretamente no contexto do tecido do rato recém-isoladas. O ensaio conta com os marcadores de superfície celular CD71, Ter119, e no parâmetro de fluxo de citometria de "dispersão para a frente ', que é uma função do tamanho da célula. O ensaio CD71/Ter119 pode ser usado para estudar progenitores eritróides durante a sua resposta ao estresse eritropoiética in vivo, por exemplo, em ratos ou camundongos anêmicos alojados em condições de baixo oxigênio. Também pode ser usado para estudar progenitores eritróides diretamente nos tecidos de ratos adultos geneticamente modificados ou embriões, a fim de avaliar o papel específico da via molecular modificado na eritropoiese.
Protocol
Discussion
A metodologia de citometria de fluxo permite investigação simultânea de qualquer função celular que pode ser detectado com um anticorpo conjugado com fluorescência específica ou ligante, incluindo marcadores da superfície celular, a expressão da proteína, a sobrevivência celular, sinalização celular usando fosfo anticorpos específicos 3 e status de ciclo celular. Estas medições podem ser feitas em cada um de uma série de estágios de diferenciação subconjuntos específicos, no contexto da r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós agradecemos o núcleo citometria de fluxo UMass: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu e Tammy Krupoch. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) e CA NIH T32-130807 (JRS). Recursos suportados pelo núcleo de Endocrinologia Diabetes Research Center conceder DK32520 também foram utilizados.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
References
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