一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出
Summary
電子常磁性共鳴（EPR）分光法はウシ大動脈内皮細胞および鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオ、Feを（MGD）を用いてヒト好中球からのスーパーオキシドラジカルアニオンから一酸化窒素を検出するために採用した<sub> 2</sub>と、それぞれ5,5 – ジメチル-1 – pyroroline-N-オキシド、DMPO、。
Abstract
低濃度で反応性窒素/酸素種（ROS / RNS）は、シグナル伝達、細胞機能の調節に重要な役割を果たしていると、免疫応答が無秩序な濃度で細胞生存率を1、2に有害である。生きているシステムでは、ROSの生成を調節する内因性および栄養抗酸化防御機構と進化してきた一方で、ROSは、酸素の正常な代謝の副産物自然に連続的に製造されており、タンパク質の機能の喪失、DNAの切断、または脂質に生じる生体分子への酸化的損傷を引き起こす可能性があります過3、最終的に細胞傷害または死亡を4につながる酸化ストレスに。
スーパーオキシドアニオンラジカル（O 2• – ）は、ペルオキシナイトライトとヒドロキシルラジカルのような生物学的システムに存在することが知られている最も高度な酸化種のいくつかの主要な前駆体である。 O 2の生成• -私は、したがって、酸化的バーストの最初の兆候を通知し、TSの検出および/または生物学的システムの隔離が重要である。このデモでは、O 2• -多形核好中球（多形核白血球）から生成されました。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）オキシダーゼ5の活性化を介して-ホルボール-12 -ミリステート-13 -アセテート（PMA）と走化性刺激により、PMN。•O 2を生成します 。
3つのアイソフォームで提供一酸化窒素（NO）合成酵素は、誘導-、神経と血管内皮-NOS、またはiNOSの、nNOSのか、eNOSのは、それぞれ、番号6を生成しないようにNADPHを用いて、L-シトルリンにL-アルギニンの変換を触媒として。ここでは、内皮細胞からNOを生成しません。酸化的ストレス条件下で、例えばeNOSのは•O 2、NOを生産に切り替えることができます-ヘム7または補助因子の酸化によって引き起こされると考えられている脱共役と呼ばれるプロセスで、テトラヒドロビオプテリン（BH 4）8。
少数がありますしかし、生体系におけるフリーラジカルの検出のための信頼できる方法は特異性と感度によって制限されます。スピントラッピングは、一般的にフリーラジカルの同定に使用され、電子常磁性共鳴（EPR）分光法によって検出することができる永続的なスピン付加物を形成するスピントラップへのラジカルの付加反応を伴うされています。様々なラジカル付加物は、生成されるラジカルを識別し、ラジカルの産生9の性質と動態に関する豊富な情報を提供することができます使用することができる独特のスペクトルを示す。
環状ニトロン、5,5 -ジメチル-ピロリン-N-オキシド、DMPO 10、ホスホリル置換されDEPMPO 11、エステル置換EMPO 12 BMPO 13は 、広くスピントラップとして採用されている-後者のスピン付加-トラップは、O 2•のために長い半減期を示す。鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオカルバミン酸のFe（MGD）2 </ SUB>は、一般的に付加体形成とスピン付加物14の高安定度の高い率のためにNOを捕捉するために使用されていません。
Protocol
Discussion
EPRスピントラップは、フリーラジカルを定量化し、識別するための生物医学アプリケーションの広い範囲で採用されている。スピントラッピングは、nMからこのように生物系のアプリケーションに適していμMの範囲の濃度でラジカルを検出することができる、非常に敏感である。常磁性の付加物の形成、NO-のFe 2 +-MGDは、EPR を経由して NOの検出の基礎となっています。のFe 2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHの国立心臓、肺、血液研究所の助成金RO1 HL81248によって資金を供給された。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
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