طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية
Summary
دراسة توضح طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مصدر تلوث برازي / البول أو التلوث النترات في المياه باستخدام qPCR الكمي للفيروسات محددة من الحمض النووي البشري / الخنزير / البقر ، والفيروسات الغدية polyomaviruses ، على النحو المقترح أدوات MST.
Abstract
التلوث الميكروبي للبيئة يمثل مخاطر صحية كبيرة. المؤشرات البكتيرية الكلاسيكية البراز أظهرت أن يكون لها حدود كبيرة ، والفيروسات وأكثر مقاومة للكثير من عمليات التعطيل والمؤشرات القياسية البراز لا تبلغ عن مصدر التلوث. تطوير أساليب فعالة التكلفة للتركيز الفيروسات من الماء والمقايسات الجزيئية يسهل انطباق الفيروسات كمؤشرات للتلوث البراز والجراثيم كمصدر تتبع الأدوات (MST). والفيروسات الغدية polyomaviruses هي فيروسات تصيب الحمض النووي الأنواع الفقارية محددة بما في ذلك البشر وتفرز بشكل مستمر في البراز و / أو البول في جميع المناطق الجغرافية التي شملتها الدراسة. في الدراسات السابقة ، واقترح علينا تحديد مقدار الفيروسات الغدية البشرية (HAdV) وpolyomaviruses JC (JCPyV) بواسطة PCR الكمي (qPCR) وذلك في مؤشر تلوث البراز البشري. في الآونة الأخيرة ، وضعنا لفحوصات qPCR الكمي محددة من البرتغالالفيروسات الغدية سينمائية (PAdV) وpolyomaviruses البقري (BPyV) كدلالة على وجود تلوث برازي الحيوانات ذات حساسيات من نسخ الجينوم 10-10 في أنبوب اختبار. في هذه الدراسة ، فإننا نقدم الإجراءات الواجب اتباعها لتحديد مصدر تلوث في عينات المياه باستخدام هذه الأدوات. ومثال على نتائج ممثلة ، يظهر تحليل الفيروسات في المياه الجوفية تقديم مستويات عالية من النترات.
الكشف عن الفيروسات في المياه الملوثة منخفضة أو متوسطة يتطلب تركيز الفيروسات ما لا يقل عن عدة لترات من الماء إلى حجم أصغر بكثير ، وهو الإجراء الذي عادة ما يتضمن الخطوات تركيز اثنين في السلسلة. هذا الإجراء مرهقة بعض الشيء ، والتباين الملحوظ في استرداد الفيروسي يعيق بشكل كبير في تجهيز المتزامن لعدد كبير من عينات المياه.
من أجل القضاء على عنق الزجاجة بسبب الإجراءات على مرحلتين لدينا تطبيق البروتوكول خطوة واحدة وضعت في السابق studieق ، وتنطبق على مجموعة متنوعة من المصفوفات المياه. الإجراء يشمل : تحمض عينات من المياه لمدة عشر لتر ، تندف من الحليب الخالي من الدسم ، والترسيب خطورة المواد flocculated ، وجمع من تعجل والطرد المركزي ، إعادة تعليق من يعجل في 10 مل العازلة الفوسفات. يتم استخدام تركيز الفيروسي لاستخلاص الأحماض النووية الفيروسية والفيروسات الغدية محددة وpolyomaviruses من الفائدة التي qPCR كميا. قد يكون عدد كبير من العينات التي تم تحليلها في وقت واحد باستخدام هذا الأسلوب تركيز منخفض التكلفة.
وقد تم تطبيق هذا الإجراء لتحليل مياه الاستحمام ومياه البحر ومياه النهر وفي هذه الدراسة ، فإننا نقدم نتائج تحليل عينات المياه الجوفية. هذا الأسلوب الإنتاجية العالية الكمية هو موثوق بها ومباشرة وفعالة من حيث التكلفة.
Protocol
Discussion
ووصف الإجراء استيفاء الشروط اللازمة للأسلوب المناسب لروتين مختبرات البيئة والصحة العامة : يمكن استنساخه ، موثوق بها ، واضحة وفعالة من حيث التكلفة. بروتوكول بسيط ، ولكن يجب اتباعها بعناية. والموصلية المنخفضة في العينات دون إضافة تركيز الأملاح المطلوبة من مياه الب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جزئيا من قبل الحكومة الاسبانية "MINISTERIO دي Educación ذ Ciencia" (مشروع AGL2008-05275-C01/ALI) ، في إطار الاتحاد الأوروبي للبحوث 7 مشاريع ممولة VIROBATHE (العقد رقم 513648) ، VIROCLIME (العقد رقم 243923 ) والوكالة الكتلانية للمياه والوكالة الكتالونية DE L' Aigua (ACA) ، Departament دي التحكم ط Millora dels Ecosistemes السباحة. أثناء الدراسة المتقدمة ومارتا Rusiñol زميل "AGAUR" الكاتالونية الحكومة (FI – DGR).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
