Costo-efficace metodo per il rilevamento di origine microbica Utilizzando specifici virus umani e animali
Summary
Lo studio descrive un metodo conveniente per l'identificazione della fonte di contaminazione fecale / urina o la contaminazione da nitrati in acqua utilizzando qPCR per la quantificazione specifica di virus DNA umano / suini / bovini, adenovirus e poliomavirus, proposti come strumenti di MST.
Abstract
La contaminazione microbica dell'ambiente rappresenta un rischio significativo per la salute. Classica indicatori batterici fecali hanno dimostrato di avere notevoli limitazioni, i virus sono più resistenti ai processi di inattivazione molti indicatori e standard fecale non informare sulla fonte di contaminazione. Lo sviluppo di metodi economici per la concentrazione di virus da acqua e saggi molecolari facilita l'applicabilità di virus come indicatori di contaminazione fecale e come fonte microbica tracking (MST) strumenti. Adenovirus e poliomavirus sono virus a DNA infettare specie di vertebrati specifici compresi gli esseri umani e sono costantemente escreto nelle feci e / o urine in tutte le aree geografiche studiate. In studi precedenti, abbiamo suggerito la quantificazione di adenovirus umani (HAdV) e poliomavirus JC (JCPyV) mediante PCR quantitativa (qPCR) come indice di contaminazione fecale umana. Recentemente, abbiamo sviluppato saggi qPCR per la quantificazione specifica di poradenovirus cine (PAdV) e poliomavirus bovina (BPyV) come animali indicatori di contaminazione fecale con sensibilità di copie del genoma 1-10 per provetta. In questo studio, presentiamo la procedura da seguire per identificare la fonte di contaminazione nei campioni di acqua di questi strumenti. Come esempio dei risultati rappresentativi, l'analisi dei virus nelle acque sotterranee presenta alti livelli di nitrati è mostrato.
Individuazione di virus in acque inquinate o moderatamente bassa richiede la concentrazione del virus da almeno diversi litri di acqua in un volume molto più piccolo, una procedura che di solito comprende due fasi concentrazione in serie. Questa procedura alquanto complesso e la variabilità osservata in recuperi virale ostacolare in modo significativo l'elaborazione simultanea di un gran numero di campioni di acqua.
Al fine di eliminare il collo di bottiglia causato dai due procedure dettagliate abbiamo applicato un passo protocollo sviluppato in Studie precedentes ed applicabile ad una varietà di matrici acqua. La procedura prevede: l'acidificazione di dieci litri di campioni di acqua, flocculazione da latte scremato, sedimentazione dei materiali flocculato, la raccolta del precipitato e centrifugazione, risospensione del precipitato in 10 ml di tampone fosfato. Il concentrato virale è utilizzato per l'estrazione di acidi nucleici virali e l'adenovirus specifico e poliomavirus di interesse sono quantificati da qPCR. Elevato numero di campioni può essere contemporaneamente analizzate con questo metodo a basso costo concentrazione.
La procedura è stata applicata per l'analisi delle acque di balneazione, l'acqua di mare e di acqua di fiume e in questo studio, presentiamo i risultati analizzando campioni di acque sotterranee. Questo high-throughput metodo quantitativo è affidabile, semplice e conveniente.
Protocol
Discussion
La procedura descritta potrebbe soddisfare le condizioni per un metodo adatto per routine laboratori ambientali e sanitarie: riproducibile, affidabile, semplice e conveniente. Il protocollo è semplice, ma che devono essere seguite attentamente. Bassa conducibilità nei campioni senza aggiungere la concentrazione richiesta di sali di acqua di mare artificiale ridurrebbe drasticamente il recupero di virus come sarebbe il caso se il tempo di agitazione per la flocculazione è significativamente ridotto (meno di 5 or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal governo spagnolo "Ministerio de Educación y Ciencia" (progetto AGL2008-05275-C01/ALI), dall'Unione Europea Quadro di Ricerca 7 progetti finanziati VIROBATHE (contratto n ° 513648), VIROCLIME (contratto n ° 243923 ) e dall'Agenzia catalana di acqua, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de controllo i Millora dels Ecosistemes Aquatics. Durante lo studio ha sviluppato Marta Rusiñol era un collega del governo catalano "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
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