특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법
Summary
연구는 산악 표준시 도구로 제안 인간 / 돼지의 / 소 DNA 바이러스, adenoviruses과 polyomaviruses의 특정 부량에 대한 qPCR을 사용하여 물속에서 nitrates에 의해 배설물 / 소변 오염 또는 오염의 소스의 식별을위한 비용 효율적인 방법을 설명합니다.
Abstract
환경의 미생물 오염 중요한 건강 위험을 나타냅니다. 고전 세균 배설물 지표는 상당한 한계를 가지고 나타났습니다, 바이러스 오염의 원인에 대한 정보를 제공하지 않는 많은 불활 성화 과정 및 표준 배설물 지표에 더 저항하고 있습니다. 물 분자 assays에서 바이러스의 농도에 대한 비용 효율적인 방법의 개발은 배설물 오염의 지표와 같은 미생물의 소스 추적 (MST) 도구와 같은 바이러스의 적용을 용이하게합니다. Adenoviruses 및 polyomaviruses 인간을 포함한 척추 특정 수종을 감염 DNA 바이러스이며 지속적으로 배설물 및 / 또는 공부를 모든 분야에서 지역 소변에서 배설됩니다. 이전 연구에서 우리는 인간 adenoviruses (HAdV)과 인간의 배설물로 오염의 인덱스로 정량 PCR (qPCR)에 의해 JC의 polyomaviruses (JCPyV)의 부량을 제안했습니다. 최근, 우리는 포의 특정 부량에 대한 qPCR의 assays을 개발했습니다cine의 adenoviruses (PAdV) 및 테스트 튜브 당 10-10 게놈 사본 감성과 오염의 동물 배설물 마커로 소 polyomaviruses (BPyV). 본 연구에서는, 우리는 이러한 도구를 사용하여 물 샘플의 오염의 원인을 확인하기 위해 따라야하는 절차를 제시한다. 대표 결과 예를 들어, nitrates의 높은 수준을 보여주고 지하수의 바이러스의 분석이 나타납니다.
낮은 또는 적당히 오염된 바다에서 바이러스가 탐지되면 훨씬 작은 볼륨, 보통 시리즈의 두 농도 단계를 포함하는 프로 시저에 물을 적어도 몇 리터에서 바이러스의 농도를 필요로합니다. 이 다소 성가신 과정 및 바이러스 recoveries에서 관찰 다양성은 크게 물 샘플을 다수의 동시 처리를 방해.
우리가 이전 studie에서 개발한 한 단계 프로토콜을 적용 두 단계 절차로 인해 발생하는 병목 현상을 제거하기 위해의 및 수상 매트릭스의 다양한 적용. 열 리터 물 샘플의 산성화, 무지방 우유에 의해 응집, flocculated 물질의 중력 침강, 침전과 원심 분리를 수집, 10 ML 인산 버퍼에있는 침전물의 resuspension를 : 프로 시저가 포함됩니다. 바이러스 집중은 바이러스 핵산과 특정 adenoviruses과 관심 polyomaviruses qPCR에 의한 계량 아르의 추출에 사용됩니다. 샘플 높은 번호는 동시에이 저렴한 비용으로 집중 방법을 사용하여 분석 수 있습니다.
절차는 입욕 물, 해수 및 하천 물의 분석에 적용이 연구에서 우리는 지하수 샘플을 분석 결과를 제시했습니다. 이 높은 처리량 정량 방법, 신뢰할 수있는 간단하고, 비용 효과적입니다.
Protocol
Discussion
재현성, 신뢰성, 간단하고 비용 효율 : 설명 절차는 일상적인 환경과 공중 보건 실험실의 피팅 방법에 대한 조건을 충족합니다. 프로토콜은 간단하다, 그러나 그것은 신중하게 따라야합니다. 응집에 대한 교반 시간이 크게 (예를 들어 미만 5 시간) 감소 경우가대로 인공 해수 염분의 요청 농도를 추가하지 않고 샘플의 낮은 전도성이 크게 바이러스의 회복을 줄일 것입니다.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 유럽 연합 (EU) 연구 프레임 워크 7 투자 프로젝트 (계약 번호 513648) VIROBATHE, VIROCLIME (계약 번호 243923로, 스페인 정부 "정부의 드 Educación Y Ciencia"(프로젝트 AGL2008-05275-C01/ALI)에 의해 지원되었다 )과 물의 카탈루냐어 기관, Agència Catalana DE L' Aigua (ACA), Departament 드 제어 내가 Millora dels Ecosistemes 수상하여. 개발 연구 기간 동안 마르타 Rusiñol는 카탈루냐어 정부 "AGAUR"(FI – DGR)의 동료했다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
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