Kostnadseffektiv metode for mikrobiell kilde Tracking med bestemte mennesker og dyr virus
Summary
Studien beskriver en kostnadseffektiv metode for identifisering av kilden til fekal / urin forurensning eller forurensning av nitrater i vann med qPCR for de spesifikke kvantifisering av menneskelig / svin / storfe DNA virus, adenoviruses og polyomaviruses, foreslått som MST verktøy.
Abstract
Mikrobiell forurensning av miljøet representerer en betydelig helserisiko. Har klassisk bakteriell fecal indikatorer vist seg å ha betydelige begrensninger, virus er mer resistente mot mange inaktivering prosesser og standard fecal indikatorene ikke informere om kilden til forurensning. Utvikling av kostnadseffektive metoder for konsentrasjonen av virus fra vann og molekylære analyser forenkler anvendelsen av virus som indikatorer på fekal forurensning og som mikrobiell kilde tracking (MST) verktøy. Adenoviruses og polyomaviruses er DNA virus infiserer spesifikke arter virveldyr, inkludert mennesker, og er vedvarende skilles ut i avføring og / eller urin i alle geografiske områder studert. I tidligere studier, foreslo vi kvantifisering av menneskelig adenoviruses (HAdV) og JC polyomaviruses (JCPyV) av kvantitativ PCR (qPCR) som en indeks for menneskelig fekal forurensning. Nylig har vi utviklet qPCR analyser for de spesifikke kvantifisering av porcine adenoviruses (PAdV) og storfe polyomaviruses (BPyV) som dyr fecal markører for forurensing med følsomheter fra 1-10 genom eksemplarer per reagensrør. I denne studien presenterer vi prosedyren som skal følges for å identifisere kilden til forurensning i vannprøver ved hjelp av disse verktøyene. Som eksempel på representative resultater, er analyse av virus i grunnvann presentere høye nivåer av nitrater vist.
Påvisning av virus i lav eller moderat forurenset vann krever konsentrasjon av virus fra minst flere liter vann i et mye mindre volum, en prosedyre som vanligvis inkluderer to konsentrasjon trinn i serien. Denne noe tungvinte prosedyren og variasjonen hos viral inngang betydelig hinder for samtidig behandling av et stort antall vannprøver.
For å fjerne flaskehalsen forårsaket av to-trinns prosedyrer vi har brukt en ett-trinns protokoll utviklet i tidligere studies og gjelder for et mangfold av vann matriser. Prosedyren omfatter: forsuring av ti-liters vannprøver, flokkulering av skummet melk, gravitasjon sedimentering av flocculated materialer, samling av bunnfall og sentrifugering, resuspendering av bunnfall i 10 ml fosfat buffer. Den viral konsentrere brukes til utvinning av virale nukleinsyrer og de spesifikke adenoviruses og polyomaviruses av interesse er kvantifisert av qPCR. Høyt antall prøver kan samtidig analyseres ved hjelp av denne lavkost konsentrasjon metoden.
Prosedyren har blitt brukt til analyse av badevann, sjøvann og elvevann og i denne studien presenterer vi resultatene analysere grunnvann prøver. Denne high-throughput kvantitative metoden er pålitelig, enkel og kostnadseffektiv.
Protocol
Discussion
Prosedyren er beskrevet ville oppfylle vilkårene for en passende metode for rutinemessig miljø og folkehelse laboratorier: reproduserbar, pålitelig, enkel og kostnadseffektiv. Protokollen er enkel, men den må følges nøye. Lav ledningsevne i prøvene uten å legge den ønskede konsentrasjon av kunstig sjøvann salter vil dramatisk redusere utvinning av virus som ville være tilfelle dersom omrøring tid for flokkulering er betydelig redusert (mindre enn 5 timer for eksempel).
Fore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av den spanske regjeringen "Ministerio de Educación y Ciencia" (prosjekt AGL2008-05275-C01/ALI), av EU forskning Framework 7 finansierte prosjekter VIROBATHE (Kontrakt nr. 513648), VIROCLIME (Contract No 243923 ) og av den katalanske Agency of Water, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de styrer jeg Millora dels Ecosistemes Aquatics. Under utviklet studiet Marta Rusiñol var en kar av den katalanske regjeringen "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
