Kostnadseffektiv metod för mikrobiell källa Spårning med specifika människors och djurs virus
Summary
I studien beskriver en kostnadseffektiv metod för identifiering av källan till fekal / urin förorening eller kontaminering av nitrater i vatten med qPCR för den specifika kvantifiering av humant / svin / nötkreatur DNA-virus, adenovirus och polyomaviruses, föreslås som MST verktyg.
Abstract
Mikrobiell förorening av miljön utgör en betydande hälsorisk. Klassisk bakteriell fekal indikatorer har visat sig ha stora begränsningar, virus är mer resistenta mot många inaktivering processer och standard fekal indikatorerna inte informera om föroreningskällan. Utvecklingen av kostnadseffektiva metoder för koncentrationen av virus från vatten och molekylära analyser underlättar tillämpningen av virus som indikatorer på fekal förorening och som mikrobiell källa tracking (MST) verktyg. Adenovirus och polyomaviruses är DNA-virus infekterar vissa ryggradsdjur inklusive människa och är ständigt utsöndras i avföring och / eller urin för alla studerade geografiska områden. I tidigare studier föreslog vi kvantifiering av humant Adenovirus (HAdV) och JC polyomaviruses (JCPyV) genom kvantitativ PCR (qPCR) som ett index av mänsklig fekal förorening. Nyligen har vi utvecklat realtids-PCR-analyser för den specifika kvantifiering av porcine Adenovirus (PAdV) och bovin polyomaviruses (BPyV) som djur fekal markörer för kontaminering med känslighet 1-10 genomet exemplar per provrör. I denna studie presenterar vi det förfarande som skall följas för att identifiera föroreningskällan i vattenprover med hjälp av dessa verktyg. Som exempel på ett representativt resultat är analys av virus i grundvatten presentera höga halter av nitrat visas.
Detektion av virus i låga eller måttligt förorenade vatten kräver koncentration av virus från minst flera liter vatten i en mycket mindre volym, ett förfarande som normalt omfattar två koncentrationen steg i serien. Denna något omständligt förfarande och variabiliteten hos virus återvinningar försvårar avsevärt samtidig bearbetning av ett stort antal vattenprover.
För att eliminera flaskhalsen som orsakas av förfarande i två steg har vi tillämpat en ett steg protokoll som utvecklats i tidigare Studies och gäller för en mångfald av vatten matriser. Förfarandet omfattar: försurning av tio liter vatten prover, flockning med skummad mjölk, allvaret sedimentering av flockade material, insamling av fällningen och centrifugering, resuspension av fällningen i 10 ml fosfatbuffert. Den virala koncentratet används för utvinning av virala nukleinsyror och specifika Adenovirus och polyomaviruses av intresse kvantifieras av qPCR. Stort antal prover kan samtidigt analyseras med denna billiga koncentration metoden.
Förfarandet har tillämpats vid analys av badvatten, havsvatten och flodvatten och i denna studie presenterar vi resultaten analyseras grundvattnet prover. Denna high-throughput kvantitativ metod är tillförlitlig, enkel och kostnadseffektiv.
Protocol
Discussion
Det förfarande som beskrivs skulle uppfylla villkoren för en passande metod för rutinmässig miljön och folkhälsan laboratorier: reproducerbar, tillförlitlig, enkelt och kostnadseffektivt. Protokollet är enkelt, men det måste följas noggrant. Låg konduktivitet i proverna utan att lägga den begärda koncentration av konstgjorda havsvatten salter skulle dramatiskt minska återvinning av virus som skulle vara fallet om omrörning tid för flockning minskar avsevärt (mindre än 5 timmar till exempel).
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har delvis stöd av den spanska regeringen "Ministerio de Educación y Ciencia" (projekt AGL2008-05275-C01/ALI), av Europeiska unionens ramprogram för forskning 7 projekt VIROBATHE (Kontrakt nr 513.648), VIROCLIME (Kontrakt nr 243.923 ) och av den katalanska byrån Vatten, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de styr jag Millora dels Ecosistemes Aquatics. Under utvecklat studien Marta Rusiñol var en karl i den katalanska regeringen "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
