पूर्व oncolytic वायरस के साथ लाइव ऊतक के Vivo संक्रमण
Summary
Oncolytic वायरस कैंसर चिकित्सा के लिए वादा कर रहे हैं. जीवित ऊतक के इलाज के लिए पहले रोगियों से प्राप्त नमूनों के infectability का पता लगाने की क्षमता इस चिकित्सात्मक दृष्टिकोण का एक अनूठा लाभ है. इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे के लिए ऊतकों की प्रक्रिया<em> पूर्व vivo</em> Oncolytic वायरस और बाद में वायरल मात्रा का ठहराव के साथ संक्रमण.
Abstract
Oncolytic वायरस (ओवर) उपन्यास चिकित्सा विज्ञान है कि चुनिंदा में दोहराने के लिए और ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के एक हैं . कई नैदानिक एचएसवी, reovirus, और कैंसर के लिए इलाज के रूप में चेचक ओवर सहित oncolytic प्लेटफार्मों की एक किस्म की प्रभावशीलता का मूल्यांकन परीक्षण वर्तमान में चल 2-5 कर रहे हैं. Oncolytic वायरस के एक प्रमुख विशेषता यह है कि वे आनुवंशिक संवाददाता transgenes जो माइक्रोस्कोपी या जैव luminescence 6,7 इमेजिंग द्वारा ऊतकों के संक्रमण की कल्पना करने के लिए यह संभव बनाता है व्यक्त करने के लिए संशोधित कर सकते हैं. यह एक अद्वितीय लाभ प्रदान करता है के बाद से यह संभव है रोगियों पूर्व vivo से ऊतकों के उपचार के लिए पहले संक्रमित क्रम में सफल oncolytic virotherapy 8 की संभावना का पता लगाने. यह अंत करने के लिए, यह उचित ऊतक विविधता के लिए क्षतिपूर्ति और ऊतक व्यवहार्यता, विशेष रूप से 9 संक्रमण के पहले का आकलन करने के लिए ऊतक का नमूना करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह भी वायरल संवाददाता transgenes का उपयोग कर यदि oncolytic मंच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से homogenization में निम्नलिखित क्रम में निष्फल और उत्पादक संक्रमण के बीच भेदभाव ऊतकों के प्रत्यक्ष अनुमापन द्वारा व्यक्त की प्रतिकृति का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इन मुद्दों को संबोधित है और यहां एक वर्णन है. और सेल संस्कृति के लिए 2 तैयारी ट्यूमर ऊतक के नमूने. ऊतक की व्यवहार्यता का आकलन चयापचय डाई alamar नीले 3 चेचक वायरस के साथ सुसंस्कृत ऊतकों या तो GFP या जुगनू luciferase 4 व्यक्त की पूर्व vivo में संक्रमण. उपयोग. Transgene अभिव्यक्ति की जांच प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या Vivo इमेजिंग प्रणाली (IVIS) 5 फीट का उपयोग करके . वायरस की पट्टिका परख मात्रा का ठहराव. यह व्यापक विधि ऊतक प्रसंस्करण के आराम, ऊतक विविधता के लिए मुआवजा, ऊतक व्यवहार्यता का नियंत्रण, और निष्फल संक्रमण और हड्डी फाइड वायरल प्रतिकृति के बीच भेदभाव सहित कई फायदे प्रस्तुत करता है .
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम के ताजा ऊतक का नमूना प्राप्त है. अगर नमूना सेल संस्कृति में एक अनुचित मीडिया (eg. पीबीएस) में ऑपरेटिंग कमरे में एक लंबे इंतजार के बाद डाला जाता है, यह ऊतक की व्यवहार्यता समझौता और infectability को रोकने सकता है. ध्यान से, सामान्य ऊतकों को स्वाभाविक रूप से अधिक ट्यूमर ऊतकों की तुलना में इन प्रभावों के लिए प्रवण है. एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु है कितने कोर ऊतक नमूना और उनके आकार की निरंतरता के लिए उपयोग किया जाता है. आकार में विसंगतियों को रोगी के नमूने भर में परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व के बाद से ऊतक hypoxia और infectectable सतह जैसे कारकों कोर और कोर तिमाहियों के आकार के आधार पर उतार चढ़ाव हो जाएगा. हालांकि यह आंशिक रूप से ऊतक slicers का उपयोग करके हल किया जा सकता है, यहाँ प्रस्तुत विधि का एक फायदा यह है कि यह अपेक्षाकृत आसान है, कम संदूषण की संभावना है, और व्यापक रूप से ऊतक प्रकार की एक किस्म के लिए लागू सहित नरम या चिपचिपा ऊतकों जो आसानी से उत्तरदायी नहीं हैं, ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया. विशेष रूप से, कोर की संख्या के क्रम में बेहतर ऊतक प्रतिनिधित्व मिल बढ़ा जा सकता है है. इसके अलावा, कोर अधिक टुकड़े (08/05 eg.) में काटा जा सकता करने के लिए अन्य संभावित assays को समायोजित करने के लिए समानांतर में डीएनए, शाही सेना, या प्रोटीन निष्कर्षण के रूप में किया जा. हालांकि, टुकड़ों की संख्या में जो कोर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आकार के लिए काटा जा सकता है है कोर, जो विभिन्न आकार corers का उपयोग करके संशोधित किया जा सकता है की वास्तविक आकार पर निर्भर करेगा. वैकल्पिक रूप से, एक ही रास्ता मदद करने के लिए reproducibly आकार ऊतक टुकड़े को प्राप्त करने के पहले एक शासक का उपयोग करने के लिए उन्हें छोटे टुकड़ों में subdividing आगे कोर की लंबाई भी है. प्रोटोकॉल अन्य वायरस को समायोजित करने के लिए स्वाभाविक रूप से संशोधित किया जा सकता है और हमने पाया है कि ऊतकों व्यवहार्य हो सकता है और 6 दिनों के लिए प्रतिकृति का समर्थन कर सकते हैं. प्रोटोकॉल आगे cytrokines सहित अन्य virally व्यक्त transgenes की माप के लिए बढ़ाया जा सकता है है. के बाद संक्रमण, ऊतकों भी आगे सेक्शनिंग और immunohistochemical विधियों, जो ऊतक ऊतक विज्ञान के आगे शोधन के लिए अनुमति देता है और कैसे यह वायरल संक्रमण 10-12 के लिए संबंधित द्वारा धुंधला हो जाना करने के लिए आयल में कर सकते हैं एम्बेडेड हो.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम 2 अंजीर में प्रस्तुत डेटा के लिए मानव शल्य नमूनों प्रदान करने के लिए डॉ. हेसाम Abdelbary धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Amphothericin B solution | Sigma Aldrich | A2942 | Use at 0.1% |
| Pennicilin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Use at 1% |
| Alamar Blue | Invitrogen | DAL1025 | |
| D-Luciferin potassium salt | Molecular Imaging Products | D-Luciferin potassium salt 1g | Resuspend in PBS at 10 mg/ml and filter on 0.22 μm filter |
| MEM powder | Gibco | #41500018 | Make in half the suggested volume to make 2X MEM and filter on 0.22 μm filter prior to use |
| Carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma Aldrich | C9481 | Make a 3% solution in deionized water and autoclave. Note that powder can take some time to resuspend |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B7920 | |
| 2 mm Biopsy punch | Miltex | MX-33-31 | |
| Double Edge Prep Blades | Personna Medical Care | 74-0002 | |
| Fluorescence disection Microscope | Leica | model M205 FA | |
| In vivo imaging system (IVIS) | Caliper Life Sciences | IVIS® 200 series | |
| Tissue Tearor | Biospec products | model 985370-395 |
References
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