Utvinning av hög molekylvikt DNA från Microbial Mats
Summary
Vi erbjuder ett förbättrat protokoll för att extrahera hög molekylvikt DNA från hypersaline mikrobiella mattor. Mikrobiella celler är separerade från mattan matrisen före DNA-extraktion och rening. Detta ökar koncentrationen, kvalitet och storlek av DNA. Protokollet kan användas för andra eldfasta prover.
Abstract
Framgångsrika och korrekt analys och tolkning av metagenomic data är beroende av effektiv utvinning av hög kvalitet, med hög molekylvikt (HMW) Webbforum DNA. Men miljö-matta prov innebär ofta svårigheter att få stora koncentrationer av hög kvalitet, HMW DNA. Hypersaline mikrobiella mattor innehåller höga halter av extracellulärt polymeriska substanser (EPS) en och salter som kan hämma nedströms tillämpningar av extraherat DNA. Direkt och hårda metoder används ofta i DNA-extraktion från eldfast prover. Dessa metoder används vanligtvis på grund av EPS i Mats, en självhäftande matris, binder DNA 2,3 under direkt lys. Som en följd av hårdare extraktionsmetoder, DNA blir uppdelad i små storlekar 4,5,6.
De DNA blir därmed olämpligt för stora sätter vektor kloning. För att kringgå dessa begränsningar, redovisar vi en förbättrad metod för att extrahera HMW DNA av god kvalitet och kvantitet från hypersaline mikrobiella mattor. Vi har anställt en indirekt metod där separation av mikrobiella celler från bakgrunden mattan matrisen genom blandning och differentierad centrifugering. En kombination av mekaniska och kemiska procedurer användes för att extrahera och rena DNA från den extraherade mikrobiella celler. Vår protokoll ger cirka 2 mikrogram HMW DNA (35-50 kb) per gram matta prov, med en A 260/280 förhållandet 1,6. Vidare föreslår förstärkning av 16S rRNA gener 7 att protokollet kan minimera eller eliminera eventuell hämmande effekter av föroreningar. Våra resultat ger en lämplig metod för utvinning av HMW DNA från mikrobiella mattor för funktionell metagenomic studier och kan tillämpas på andra miljöprover från vilken DNA-extraktion är en utmaning.
Protocol
Discussion
Med tanke på att de totala celler avlägsnas från komplexa och mycket olikartade prover mikrobiell matta inte är praktiskt, är det främsta problemet hur väl de extraherade cellerna representerar gemenskapens övergripande mikrobiell matta. I en tidigare studie visade PCR-DGGE analys av mikrobiella 16S rRNA gener som de fem cellen tas bort stegen används i detta protokoll extrakt celler som är representativa för den totala mikrobiella mattan samhället 7. Det faktiska antalet celler utvinning steg som…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av National Science Foundation Environmental Genomics programmet (bidrag nr EF-0.723.707).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
References
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. Recovery of DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).
- Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials. J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).
- Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples. Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).
- de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis. Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats. Biotechniques. 49, 631-640 (2010).
- Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics. Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).
- Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).
- Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea. Science. 289, 1902-1906 (2000).
