La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero
Summary
Nous décrivons une méthode pour traiter et d'un écran moustiques récoltés sur le terrain pour une diversité des virus par un test de culture de cellules Vero. En employant cette technique, nous avons détecté 9 virus différents de 4 familles taxonomiques dans les moustiques collectés dans le Connecticut.
Abstract
Les moustiques transmettent un certain nombre de virus distincts, y compris d'importants agents pathogènes humains tels que le virus West Nile, virus de la dengue et le virus chickungunya. Beaucoup de ces virus se sont intensifiées dans leurs gammes endémiques et élargi à de nouveaux territoires, ce qui nécessite des programmes efficaces de surveillance et de contrôle pour répondre à ces menaces. Une stratégie pour surveiller l'activité des virus consiste à recueillir un grand nombre de moustiques à partir de sites endémiques et les tests d'infection virale. Dans cet article, nous décrivons comment manipuler, traiter, et d'un écran prélevés sur le terrain pour les moustiques virus infectieux par un test de culture cellulaire Vero. Les moustiques sont triés par emplacement des pièges et des espèces, et regroupés en pools contenant ≤ 50 individus. Pooled spécimens sont homogénéisés dans une solution saline tamponnée en utilisant un mélangeur-broyeur et la phase aqueuse est inoculé à des confluents des cultures de cellules Vero (Clone E6). Les cultures cellulaires sont surveillés pour effet cytopathique de jours 3-7 après l'inoculation des virus et des mises en culture cellulaire sont identifiés par les tests de diagnostic appropriés. En utilisant cette approche, nous avons isolé 9 virus différent de moustiques collectés dans le Connecticut, USA, et parmi eux, 5 sont connus pour causer la maladie humaine. Trois de ces virus (virus du Nil occidental, le virus de Potosi et La Crosse virus) représentent de nouveaux records pour l'Amérique du Nord ou la région de la Nouvelle-Angleterre depuis 1999. La capacité de détecter une grande diversité de virus est essentielle à la surveillance établis et les nouveaux virus émergents dans la population de moustiques.
Protocol
Discussion
Dosage de la culture de cellules Vero sert comme une méthode efficace pour les moustiques écran prélevés sur le terrain pour une diversité des virus. Cela contraste avec les méthodes moléculaires qui ciblent spécifiquement une ou quelques virus d'intérêt. Par ailleurs, nous avons constaté que Vero essai de culture de cellules est tout autant, sinon plus sensible que la RT-PCR 7 et nous fournit des isolats de virus qui sont stockés dans notre collection de référence pour de futures études. N…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à souligner la contribution importante des Drs. John Anderson, Andrew Main et Shirley Tirrell à cette étude. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) et le US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 et CONH00773).
Materials
| Name of reagent/ equipment | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Fetal bovine serum | Gibco – Invitrogen | 16140 |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco – Invitrogen | 15240 |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | Gibco – Invitrogen | 25080 |
| L-Glutamine 200mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | Gibco – Invitrogen | 11700 |
| 10X Dulbecco’s PBS | Gibco – Invitrogen | 14080 |
| Trypsin-EDTA | Gibco – Invitrogen | 15400 |
| Rabbit serum | Gibco – Invitrogen | 16120 |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353112 |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353108 |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
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