قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة
Summary
ويتم قياس الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني حركية النسخي على جينات معينة في الخلايا الحية. والموسومة fluorescently mRNAs مستنسخة من الجينات ذات الاهتمام به والانتعاش بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) يتم الحصول على الحركية في الجسم الحي من استطالة النسخي.
Abstract
النشاط الترانسكربتي من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني (بول الثاني) هو عملية دينامية وحركية قياس ذلك من عملية الترانسكربتي في الجسم الحي هو من الأهمية. وقد تم قياس حركية بول الثاني باستخدام طرق كيميائية حيوية أو الجزيئي. 1-3 في السنوات الأخيرة ، مع تطور أساليب التصور الجديد ، فقد أصبح من الممكن متابعة النسخ كما يحدث في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية واحد. 4 هنا ونحن تصف كيفية لإجراء تحليل للبول حركية استطالة الثاني على جينات معينة في الخلايا الحية. 5 و 6 عن طريق خط الخلية التي يمكن أن تكون موضع جين معين (DNA) ، ناتجها مرنا ، والمنتج النهائي من البروتين fluorescently المسمى وتصور في الجسم الحي ، فمن الممكن للكشف عن النسخ الفعلية للmRNAs على الجينات في المصالح. fluorescently المفتاحية هي 7 و 8 ومرنا باستخدام نظام MS2 mRNAs للعلامات في الجسم الحي ، حيث 3'UTR من النصوص مرنا يحتوي على 24 حلقة MS2 الجذعية يكرر ، والتي توفر مواقع محددة للغاية ملزمة للبروتين معطف YFP – MS2 أن التسميات مرنا كما هو كتب 9 رصد حركية النسخ نستخدم الاسترداد بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) الأسلوب. بواسطة photobleaching النصوص YFP – MS2 الموسومة الوليدة في موقع النسخ ثم بعد استرداد هذه الإشارة على مر الزمن ، ونحن الحصول على معدل تجميعي للmRNAs أدلى حديثا. 5 وبعبارة أخرى ، YFP – MS2 مضان يعكس الانتعاش الجيل من جديد MS2 الجذعية الحلقات في محاضر الوليدة وملزم من قبل الفلورسنت YFP – MS2 الجزيئات الحرة من دخول nucleoplasm المحيطة بها. ثم يتم تحليل المنحنيات الانتعاش FRAP باستخدام نماذج رياضية رسمية الآلي من خلال سلسلة من المعادلات التفاضلية ، من أجل استرداد المعلمات الوقت الحركية من النسخ.
Protocol
Discussion
ويمكن تقسيم طريقة لقياس النشاط بوليميريز الحركية في الخلايا الحية إلى قسمين. الجزء الأول يصف "الرطب" الإجراء الذي يتيح للقياس واسترجاع البيانات من النسخ الحركية مرنا ، بينما في الجزء الثاني ، ويتم تحليل البيانات باستخدام نموذج ODE 5 هناك عدد من الدراسات الت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم YS – T من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC) ، ومؤسسة العلوم اسرائيل (ISF) (250/06) وقوى الأمن الداخلي Bikura ، صندوق أبحاث السرطان في إسرائيل (ICRF) والألمانية الإسرائيلية مؤسسة للبحوث العلمية والتنمية (GIF ) ، الولايات المتحدة الأمريكية وإسرائيل مؤسسة العلوم ثنائية القومية (BSF) ، والألمانية الإسرائيلية مشروع التعاون (DIP) ، والوزارات الإسرائيلية للعلوم والصحة ، وأسرة جين Lebell ستيرن زميل في علوم الحياة في جامعة بار ايلان. YB ممتن للمؤسسة أزريلي لنيل الجائزة لزمالة أزريلي.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
References
- Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
- Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
- Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
- Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
- Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
- Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
- Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
- Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
- Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
- Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
- Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
- Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
- Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
- Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
- Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
