Измерение кинетики мРНК Транскрипция в одиночных камерах Жизнь
Summary
РНК-полимеразы II транскрипционных кинетики измеряются на определенных генов в живых клетках. мРНК транскрибируется из генов, представляющих интерес, флуоресцентно меченых и с помощью флуоресцентной Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) в естественных условиях кинетика транскрипционных удлинения получены.
Abstract
Транскрипционной активности РНК-полимеразы II (Пол II) представляет собой динамический процесс, и поэтому измерения кинетики транскрипционного процесса в естественных условиях имеет важное значение. Pol II кинетики была измерена с помощью биохимических или молекулярных методов. 1-3 В последние годы с развитием новых методов визуализации, это стало возможным следовать транскрипции, как это происходит в реальном времени в единый живых клеток. 4 Здесь мы описываем, как проводить анализ Pol II удлинение кинетики на конкретный ген в живые клетки. 5, 6 Используя линию клеток, в которых конкретные локуса гена (ДНК), его мРНК продукта и конечного продукта белок может быть флуоресцентно меченных и визуализируется в естественных условиях , то можно обнаружить фактическое транскрипции мРНК на интересующего гена. 7, 8 мРНК флуоресцентно меткой использованием MS2 системы для мечения РНК в живом организме, где 3'UTR мРНК стенограммы содержат 24 MS2 стволовых петля повторы, которые обеспечивают высокую конкретные сайты связывания для YFP-MS2 белка оболочки, которая маркирует мРНК как транскрибируется 9. Для контроля кинетики транскрипции мы используем флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) метод. По фотообесцвечивания YFP-MS2-меткой нарождающегося стенограммы на сайте транскрипции и затем, после восстановления этого сигнала с течением времени, мы получаем скорость синтеза мРНК новоиспеченных 5. Другими словами, YFP-MS2 флуоресценции восстановления отражает поколения новых MS2 стволовых петель в зарождающейся стенограмм и их связывания флуоресцентных свободной YFP-MS2 молекул, поступающих из окружающей нуклеоплазмы. Кривые восстановления FRAP которые затем анализируются с помощью математических моделей механистической оформляется серии дифференциальных уравнений, для того, чтобы получить кинетических параметров время транскрипции.
Protocol
Discussion
Метод измерения кинетической полимеразной активности в живых клетках может быть разделена на две части. Первая часть описывает «влажным» процедура, которая дает возможность измерения и извлечения из кинетических данных транскрипции мРНК, тогда как во второй части, данные анализиров?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T поддерживает Европейский исследовательский совет (ERC), Израиль Science Foundation (ISF) (250/06), ХОЯТ-бикура, Израиль онкологический научный фонд (ICRF), германо-израильского фонда научных исследований и развития (GIF ), США-Израиль Двусторонней научный фонд (ЧФ), германо-израильского проекта сотрудничества (DIP), а также израильским министерствами науки и здравоохранения, и Джейн Стерн Lebell семьи научный сотрудник в области наук о жизни в университете Бар-Илан. YB благодарит Фонд Азриэли для присуждения стипендии Азриэли.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
References
- Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
- Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
- Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
- Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
- Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
- Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
- Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
- Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
- Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
- Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
- Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
- Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
- Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
- Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
- Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
