Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen
Summary
RNA-Polymerase II Transkription Kinetik auf bestimmte Gene in lebenden Zellen gemessen. mRNAs aus dem Gen von Interesse transkribiert werden fluoreszenzmarkierten und mit Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der in vivo Kinetik von Transkriptions-Dehnung erhalten werden.
Abstract
Die transkriptionelle Aktivität der RNA-Polymerase II (Pol II) ist ein dynamischer Prozess und damit die Messung der Kinetik der Transkription in vivo von Bedeutung ist. Pol II Kinetik gemessen wurden mit biochemischen oder molekularbiologischen Methoden. In den letzten Jahren 1-3, mit der Entwicklung neuer Visualisierungs-Methoden ist es möglich geworden, um die Transkription zu folgen, wie es in Echtzeit geschieht in einzelnen lebenden Zellen. 4 hierin beschreiben wir, wie durchführen Analyse der Pol II Dehnung Kinetik auf ein bestimmtes Gen in lebenden Zellen. 5, 6 mit einer Zelllinie, in denen ein bestimmtes Gen-Locus (DNA), die mRNA Produkt, und die endgültige Protein-Produkt fluoreszenzmarkierten und visualisiert werden können in vivo , ist es möglich, die tatsächliche Übertragung der mRNAs auf dem Gen von Interesse zu erkennen. 7, 8 Die mRNA fluoreszierend markiert wird mit dem MS2-System für die Kennzeichnung mRNAs in vivo, in denen die 3'UTR der mRNA-Transkripte enthalten 24 MS2 stem-loop wiederholt, die sehr spezifische Bindungsstellen für den YFP-MS2-Hüllprotein, dass die mRNA-Etiketten, wie sie transkribiert wird stellen. 9 Zur Überwachung der Kinetik der Transkription nutzen wir die Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)-Methode. Durch Bleichen des YFP-MS2-tagged entstehenden Transkripte an der Stelle der Transkription und dann nach der Erholung von diesem Signal im Laufe der Zeit haben wir die Synthese-Rate der neu gemacht mRNAs zu erhalten. 5 In anderen Worten, spiegelt YFP-MS2 Fluoreszenz Erholung der Erzeugung der neuen MS2 Stem-Loops in der aufkeimenden Transkripte und deren Bindung von fluoreszierenden freien YFP-MS2 Moleküle, aus den umliegenden Kernplasma. Die FRAP Erholung Kurven werden dann analysiert mit Hilfe mathematischer mechanistischen Modellen durch eine Reihe von Differentialgleichungen formalisiert, um die kinetische Zeitparameter der Transkription abzurufen.
Protocol
Discussion
Die Methode zur Messung Polymerase kinetische Aktivität in lebenden Zellen lassen sich in zwei Teile aufgeteilt werden. Der erste Teil beschreibt die "nassen" Verfahren, das die Mess-und Abrufen der kinetischen Daten der mRNA Transkription ermöglicht, während im zweiten Teil, werden die Daten analysiert mit Hilfe eines ODE-Modell. 5 Eine Reihe von Studien haben nun diesen Ansatz zur Extraktion verwendet Transkription Kinetik in lebenden Zellen 5, 6, 8, 12-14. Der wesentliche Unterschie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T wird von der European Research Council (ERC), der Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israel Cancer Research Fund (ICRF), Deutsch-Israelische Stiftung für Wissenschaftliche Forschung und Entwicklung (GIF unterstützt ), USA-Israel Binationale Science Foundation (BSF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP), und die israelischen Ministerien für Wissenschaft und Gesundheit und ist der Jane Stern Lebell Familie Fellow in Life Sciences an der Bar-Ilan University. YB ist dankbar für die Azrieli Stiftung für die Vergabe eines Stipendiums Azrieli.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
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