RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA'ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.
Abstract
RNA polimeraz II (Pol II) transkripsiyonel aktivitesini dinamik bir süreçtir ve bu nedenle in vivo transkripsiyonel sürecin kinetiği ölçülmesi önem taşımaktadır . Pol II kinetiği, biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılarak ölçüldü 1-3, son yıllarda yeni görüntüleme yöntemlerinin gelişmesi ile, gerçek zamanlı olarak tek bir canlı hücreler olarak ortaya çıkar transkripsiyon takip etmek mümkün hale gelmiştir 4 Burada nasıl tarif belirli bir gen lokusu (DNA), mRNA ürün ve nihai bir protein ürünü floresan etiketli ve in vivo görüntülendi hangi bir hücre satırını kullanarak canlı hücrelerin belirli bir gen Pol II uzaması kinetik analizi gerçekleştirmek için 5, 6 mRNA'ların gerçek transkripsiyon, ilgi gen tespit etmek mümkündür. 7, 8 mRNA floresan in vivo, mRNA transkript 3'UTR 24 MS2 kök-loop içeren, etiketleme mRNA'ların MS2 sistemi kullanılarak etiketlenir mRNA transkripsiyonu gibi etiketler YFP MS2 kat protein bağlama bölgeleri için son derece özel sağlar tekrarlar, 9 (sıkı bağlamak) yöntemi Photobleaching sonra Floresan Kurtarma transkripsiyon kinetiği izlemek için. Transkripsiyon yerinde YFP-MS2 etiketli doğmakta olan transkript photobleaching ve sonra zamanla bu sinyal kurtarma, yeni yapılan mRNA'ların sentezi oranı edinin. 5. Diğer bir deyişle, YFP-MS2 floresan kurtarma nesil yansıtır , yeni MS2 doğmakta olan transkript ve floresan YFP-MS2 çevreleyen çekirdek plazması giren moleküller tarafından, bağlayıcı kök döngüler. Daha sonra sıkı bağlamak kurtarma eğrileri, transkripsiyon kinetik parametreleri almak için, diferansiyel denklemlerin bir dizi resmiyet matematiksel mekanik modelleri kullanılarak analiz edilmektedir.
Protocol
Kullanılan hücre sistemine etiketleme canlı hücrelerde mRNA MS2 tekrar dizileri içeren entegre bir gen inşa içermelidir. Genin 5 'lac operatör içerir (Bu protokolde floresan aşağıdaki gibidir (Şekil 1A), DNA, RNA ve protein düzeyleri 8 harfli bir stably entegre β-aktin gen barındıran U2OS bir insan hücre hattı Laço) tekrarlar bu gen (DNA) etiketlemek için kullanılır ve böylece entegrasyon genomik lokus tespit. Floresan etiketli lak repressör pro…
Discussion
Canlı hücreler polimeraz kinetik aktivitesini ölçmek için yöntem iki bölüme ayrılabilir. Ilk bölümü, ikinci bölümünde, veri ODE model kullanılarak analiz ise, ölçüm ve mRNA transkripsiyon kinetik verileri almak 'ıslak' prosedürü açıklamaktadır. 5 ayıklamak için bir dizi çalışma yaklaşımıdır canlı hücreler 5, 6, 8, 12-14 transkripsiyon kinetiği. Bu çalışmalar arasında en önemli fark, sıkı bağlamak kurtarma eğrisi kinetik parametreleri dönüştü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T için Almanca-İsrail Bilimsel Araştırma ve Geliştirme Vakfı, Avrupa Araştırma Konseyi (ERC), İsrail Bilim Vakfı (ISF) (250/06), ISF Bikura, İsrail Kanser Araştırma Fonu (ICRF), (GIF tarafından desteklenmektedir ), ABD-İsrail Binational Bilim Vakfı (BSF), Alman-İsrail Projesi İşbirliği (DIP), İsrail Bilim ve Sağlık Bakanlıkları, Bar-Ilan Üniversitesi Yaşam Bilimleri Jane Stern Lebell Aile Üyesi. YB, bir Azrieli dostluk ödül için Azrieli Vakfı minnettardır.