Microiontophoresisは、マイクロピペットの内側と外側との間の電位の差に応答して、マイクロピペットからのイオンの動きを伴います。生物学的活性分子は、それによって電流に比例して配信されます。我々は、微小循環の内皮依存性血管拡張を研究するためにマイクロマニピュレーションと連携してアセチルコリンのmicroiontophoresisを示しています。
Microiontophoresisは実験的な準備の中で指定されたサイトでの溶質を提供するためにマイクロピペット先端部を流れる電流の通過を伴います。 Microiontophoresisは再現性ニューロン2の上に神経伝達物質および神経ペプチドを提供することにより、シナプス伝達1をシミュレートすることができます。無視できる量は(流体)の変位は、実験的な準備に機械的な障害を回避することができます。微小循環3にこれらの技術を適応させる血管拡張と血管収縮のメカニズムをin vivoで 4,5 の顕微鏡レベルで検討することが可能になりました。このような局所的輸送の主要な利点は、それによって血管の固有の特性を明らかに、血圧と組織の血流に全身または反射的な変更を想起させることなく、微小血管ネットワーク内で定義されているサイトで勉強する血管運動応答を可能にしています。
microiontophoresisの制限は、興味のあるサイトに配信エージェントの正確な濃度が6を把握することが困難なことです。それにもかかわらず、マイクロピペットの先端からのリリースでは、2,7現在の放出の強さと持続時間に比例する、ように再現性の刺激-反応関係は、容易に定義されている実験条件(後述)の下に決定することができます。 microiontophoretic配信に影響を及ぼすその他の要因は、溶質濃度と溶液中でのイオン化が含まれています。マイクロピペットの先端の内径は、保持電流を相殺することができます拡散"漏れ"を最小限に抑えるために、〜1μm以下にする必要があります。したがって、外側(正)現在は、マイクロピペット内に保持するために使用される陽イオンと負の電流を取り出すために使用されます。
マイクロピペットの作製は、洗練された電子車夫8で促進される。マイクロピペットは、バックエンド("埋め戻す")から充填マイクロピペットの先端に"芯"解決策そのフィラメントを含有するガラス毛細管から抜き出されます。これは、マイクロピペットの内腔に関心や取り出しソリューションのソリューションを含むシリンジに接続されているマイクロキャピラリーチューブを挿入することによって行われます。マニピュレーターは、実験準備中マイクロピペットの所望の配置を有効にしてください。可動ベースに搭載されたマイクロマニピュレータは、微小血管ネットワーク(以下開発)の地形に応じて準備の周りに配置することができます。
内皮依存性血管拡張を生成するために:(JoveのIDは#2874に関連付けられたプロトコルを参照)マウスの精巣挙筋の準備の小動脈に–現在のプロトコルは、アセチルコリン(ACH + Cl)のmicroiontophoresisを示しています。刺激の配信は電子トリガを使用してデジタル化された画像取得と同期しています。 CX40 BAC – GCaMP2トランスジェニックマウス9の使用は、生活の微小循環に細動脈内皮細胞の血管拡張の基盤となる細胞内カルシウム応答の可視化を可能にします。
ここで記述されたプロトコルはmicroiontophoresis用マイクロピペットを準備し実施するための方法を示しています。アセチルコリンの配信を、麻酔下のマウスの動脈にカルシウムシグナリング基礎内皮依存性血管拡張を説明するために使用されます。我々の結果は示しているアセチルコリンはmicroiontophoresisのマイクロピペット(図3)から現在の放出の強さで内皮細胞のカルシウムの蛍光の増加を増加する距離。安静時に蛍光増加の欠如は、マイクロピペットからのアセチルコリンの無視できる漏れを示します。 100nAの刺激の強度(図3、伝説)への応答の欠如は、刺激の閾値強度が増加する内皮細胞のカルシウムが必要であることを示しています。これらの技術は、容易に他の血管作動性薬剤と組織の準備に適応することができます。
実用的な考慮事項:細動脈の反応性を研究するmicroiontophoresisでの作業では、いくつかのことが認識されるべきである。それは納入アゴニストの実際の濃度を決定するために困難であることが判明している一方で、刺激 – 反応曲線は準備中との間で再現性があります。これらは、(;図3例、250、500、1000 nAの)パルス幅を一定に保持している(例えば、500ミリ秒)と現在の放出を変化させることによって行うことができます。また、現在の放出を一定に保つことができる(例えば、500 nAの)とパルス幅様々な(例えば、250、500および1000ミリ秒)。定義されたアゴニストの濃度のアクションへの参照の場合、製剤は、適切なソリューションを5で灌流することができます。溶質放出の駆動力は電荷の運動なので、配信されるエージェントは、マイクロピペットから避難する正味の電荷を運ぶ必要があります。興味のエージェントが一次電荷キャリアであることを保証するために、それは電気浸透を最小限に抑えるために高濃度(例えば、アセチルコリンのための1 M)で溶解される。これはマイクロピペット充填溶液のpHを操作する必要があるときは、車両のコントロールはどの非特異的な影響を把握する必要があります。適切なコントロールがまた単独での電流の通過のために実行する必要があります(例えば、等張生理食塩水で満たされたマイクロピペットを用いて)。リリースのそのサイトからのエージェントの普及のための効果的な距離は知ることが必要とマイクロピペットの位置にあるように最も容易に生理学的な応答(例えば、血管拡張やアセチルコリンの放出時に細胞内カルシウムの上昇)の消失によって経験的に決定され標的部位からの距離を定義する。実際には、効果的な拡散距離が大幅にマイクロピペットの先端が組織にどのように配置するかによって影響され、組織とその先端に押さ先端が閉塞されている場合など、排出が損なわれているよりも。過剰な結合組織は、特に面倒ですし、手術の準備中に、組織の表面から除去されるべきである。注目は、指定されたエージェントの先端を破壊する可能性を考慮する必要があります。これは、比較的短いパルス(例えば、≤1秒)を用いて最小化されます。持続的な電流(例えば、数秒)で、アゴニストは、それがマイクロピペットで、バルク充填溶液からの拡散によって置き換えることができるよりも急速に先端から追放されることがあります。
一つ(例えば、+刺激を脱分極Kを配信するために)localイオン環境を変更しようとしている場合は無視できるボリュームは、microiontophoresisで置換されているので、これは以下にmicroiontophoresisで達成することはできますが、容易に希望をのバルク流体の圧力の排出によって達成される組成物。細動脈の局所的刺激の場合は2〜3μmの内径を持つマイクロピペットの先端には噴射圧力4月5日PSI(28から35 kPa)のと電磁弁10を制御するパルス幅(例えば、1秒)でうまく動作。微小血管へマイクロピペットからのエージェントの持続的な配信が必要な場合には、圧力の取り出しは、適切な内部先端径(例えば、〜10μm)を11,12のマイクロピペットを用いて好適である。活栓バルブの既知の高さの静水圧列には、一定の圧力ヘッドのオン/オフの明確に定義された、安価に提供します。流量は、ピペットチップと駆動圧力の内径によって決定されます。いつものように、車両のコントロールは、圧力放出の非特異的な行動を排除するために不可欠です。
The authors have nothing to disclose.
著者らの研究室では、健康補助R37 – HL041026、R01 – HL086483とR01 – HL056786(SSS)と米国公衆衛生局からF32 – HL097463とT32 – AR048523(PB)での国民の協会によってサポートされています。
Material Used | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | model P-97 | |
Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
5 ml syringe | Becton-Dickinson Co. | 309603 | |
Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
3-axis micromanipulator | Siskiyou Design Instruments | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments | Model 260 | |
trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8″ X 12″ X 12″ | According to design |
Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |